Петли и домены ДНК для ее спирализации

Обновлено: 18.04.2024

В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата. На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гистонов в хроматиновых фибриллах. Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так при осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматина представляли собой что-то, напоминающее "бусы на нитке": небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм. Эти наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания. Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиеся структуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой, состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезки в 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, что нуклеазной атаке в составе хроматина подвергаются участки ДНК, расположенные примерно через каждые 200 п.н. При этом в кислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2% ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростью седиментации 11S (S - единица Сведберга, определяющая скорость седиментации частиц, равна 1 х 10 -13 с), а также частицы кратного этой величине размера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. Оказалось, что частицы 11S содержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер) по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы. Более подробный анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто в нашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица), по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белками сердцевины - линкер, который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной, сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. - участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1. Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 х 10 9 пар оснований) приходится 1,5 х 10 7 нуклеосом. Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) очень консервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамер гистонов. Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н. на нуклеосому). Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точные размеры нуклеосом. При грубом приближении - это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования они образуют «бусины», глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3 · H4)₂ и два независимых димера H2A · H2B.

В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спираль ДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом. При этом за счет дополнительной спирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому) происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.

Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя последовательность добавления гистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это может быть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что для образования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании уже готовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровней компактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны H3 и H4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3 · H4)₂ к которому позжеприсоединяются два димера H2A · H2B. Вероятно, высокая консервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образовании нуклеосом.

Вопрос 60. Второй и третий уровень организации хромотина.

Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов - нуклеосом и 30 нм фибрилл - еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 10 4 ) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. «гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название «нуклеоида». Гало состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. «матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca ++ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н. хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат. При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК.Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером среднихрепликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса. Второй уровень компактизациии - 30 нм фибрилла: Т.о первый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет как регуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК приблизительно в 6-7 раз.Однако во многих электронномикроскопических исследованиях было показано, что как в митотических хромосомах, так и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина с диаметром 30 нм. Хроматиновые фибриллы такого диаметра были видны как на ультратонких срезах после фиксации глутаровым альдегидом, так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хромосом в растворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов. Все это говорило о том, что нуклеосомные цепочки хроматина каким-то специфическим образом уложены так, что возникает не хаотическая агрегация нуклеосом, а правильная нитчатая структура с диаметром 30 нм. Относительно характера упаковки нуклеосом в составе 30 нм фибриллы хроматина существует, по крайней мере, две точки зрения. Одна из них защищает, т.н. соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует в свою очередь спиральные витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится 6 нуклеосом. В результате такой упаковки возникает фибрилла спирального типа с центральной полостью, которая иногда на негативно окрашенных препаратах бывает видна как узкий «канал» в центре фибриллы. При частичном разворачивании, декомпактизации такой фибриллы и нанесении ее на подложку хорошо видно «зигзагообразное» расположение нуклеосом вдоль фибриллы. Считается, что гистон H1 обеспечивает взаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая их друг с другом, но и обеспечивая кооперативную связь нуклеосом так, что образуется довольно плотная спираль из 10 нм фибриллы. Удаление, даже частичное, гистона H1 вызывает переход 30 нм фибриллы в 10 нм фибриллу, а полное удаление его вызывает разворачивание последней в структуру типа «бусин-на-нити». Такой соленоидный тип упаковки ДНК приводит к плотности упаковки равной приблизительно 40 (т.е. на каждый мкм нити приходится 40 мкм ДНК). Эти представления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощью дифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, что представление о соленоидном типе укладки получены из анализа вторично конденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина в присутствии ЭДТА или выделялись в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин деконденсировался до уровня «бусин на нити», где отсутствует или дестабилизируется контакт между нуклеосомами. Если же исследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но при поддержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ), то можно видеть дискретность в составе 30 нм фибрилл хроматина: она состоит как бы из сближенных глобул того же размера, из нуклеомеров. В зарубежной литературе такие 30 нм глобулы или нуклеомеры получили название сверхбусин («супербиды»). Было обнаружено, что если в условиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препараты хроматина подвергнуть нуклеазной обработке, то часть хроматина растворяется. При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм с коэффициентом седиментации равным 45S в растворах, содержащих 1 мМ магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА, удалить ионы магния, то они разворачиваются в нуклеосомные цепочки, содержащие 6-8 нуклеосом. Таким образом, в состав одного нуклеомера входит отрезок ДНК, соответствующий 1600 парам оснований или 8 нуклеосомам. Компактность нуклеомера зависит от концентрации ионов магния и наличия гистона. Негистоновые белки в конформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.

Таким образом основная 30 нм фибрилла хроматина представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК. Вероятно, что гистоны H1, находясь в центральной зоне этой крупной частицы, взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этого говорят данные о кооперативном связывании гистонов H1 в группе по 6-8 молекул. Противоречие между соленоидной и нуклеомерной моделью упаковки нуклеосом в составе фибрилл хроматина может быть снято, если принять модель нерегулярного соленоида: число нуклеосом на виток спирали не является строго постоянной величиной, что может привести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом на виток. Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40 кратное уплотнение ДНК, что важно не только для достижения целей компактизации гигантских молекул ДНК. Компактизация ДНК в составе 30 нм фибрилл хроматина может налагать дополнительные функциональные ограничения. Так было обнаружено, что в составе 30 нм фибриллы хроматина ДНК становится практически недоступной для взаимодействия с таким ферментом как метилаза ДНК. Кроме того резко падает способность хроматина связываться с РНК-полимеразой и рядом регуляторных белков. Таким образом второй уровень компактизации ДНК может играть роль фактора, инактивирующего гены.В заключении необходимо еще раз напомнить, что как нуклеосомный, так и нуклеомерный (супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, но и в их кооперативном объединении в виде фибрилл ДНП, где ДНК претерпевает дополнительную сверхспирализацию. Все остальные уровни компактизации связаны с дальнейшим характером укладки 30 нм фибрилл в новые компактизационные уровни, где ведущую роль играют негистоновые белки.

Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина

Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов - нуклеосом и 30 нм фибрилл - еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 104) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Таким образом следующие более высокие уровни компактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной или митотической хромосомы.

Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.

Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. «гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название «нуклеоида» (это только терминологическое сходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. «матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, они получили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) участков.

Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca++ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н.хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.

Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ). В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическую композицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, что отдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру. Это - розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл, соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистых розеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина - хромомеры - можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных, растений, простейших (рис. 63).

Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальных препаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковилных структур (рис. 64).

Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65). При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.

Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК (рис. 66).

Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером средних репликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса.

Петли и домены ДНК для ее спирализации

• В интерфазном хроматине ДНК отрицательно суперспирализована и образует независимые домены размерами около 85 тпн

• Метафазные хромосомы обладают опорной белковой структурой, к которой присоединены петли суперспирализованной ДНК

Характерная полосатость структуры каждой хромосомы вызвана скручиванием дезоксирибонуклеопротеидной фибриллы. При участии белкового матрикса фибрилла образует петлеобразные структуры. Нуклеоид бактерий также организован в форме петель, однако молекулярные основы этой организации носят иной характер. Это обнаруживается при исследовании свойств хромосомного материала, который высвобождается при мягком лизисе клеток бактерий и эукариот.

При лизисе клеток Е. coli происходит высвобождение фибрилл, имеющих форму петель, связанных с фрагментами клеточной оболочки. Как можно видеть из рисунке ниже, ДНК в этих петлях находится не в виде протяженных двунитевых структур, а связана с белками в компактные образования. Нуклеоид может быть выделен в виде быстроседиментирующего комплекса, по весу содержащего около 80% ДНК.

Характерная особенность ДНК изолированного нуклеоида бактерий состоит в том, что она проявляет свойства замкнутого дуплекса. Об этом свидетельствует ее отношение к бромистому этидию. Небольшие молекулы этого красителя интеркалируют между парами оснований и генерируют положительные супервитки в «замкнутых» циркулярных (кольцевых) молекулах ДНК В такой молекуле не нарушена целостность обеих цепочек ДНК (В «открытой» циркулярной (кольцевой) молекуле, содержащей разрыв в одной из цепочек, или в случае линейных молекул ДНК при интеркаляции вращается свободно, тем самым снимая напряжение.)

При лизисе клеток Е. coli нуклеоид выделяется в виде собранных в петли фибрилл.

В процессе выделения в компактной структуре нуклеоида могут возникать разрывы; также они образуются при его ограниченной обработке ДНКазой. Однако это не влияет на способность бромистого этидия генерировать в ДНК положительные супервитки. Способность генома реагировать с бромистым этидием при наличии разрывов в ДНК, свидетельствует о существовании множества независимых хромосомных доменов; степень суперспирализации в каждом домене не зависит от состояния суперспиралей в соседних доменах.

Каждый домен состоит из цепи ДНК, концы которой каким-то (неизвестным) образом фиксированы, что не позволяет вращательному усилию распространяться на другие домены.

В клетке, где ковалентно-замкнутая ДНК суперпирализована отрицательно, при интеркаляции бромистого этидия вначале удаляются отрицательные супервитки, а затем образуются положительные. Количество интерка-лятора, необходимое для полной релаксации супервитков, зависит от исходной плотности отрицательных супервитков. Раньше считалось, что каждый домен содержит примерно 40 тпн ДНК, однако, согласно последним данным, размер каждого домена может быть меньше и составляет около 10 тпн.

Это означает, что в геноме Е. coli содержится порядка 400 доменов. По-видимому, концы доменов не фиксируются на определенных сайтах хромосомы, а расположены случайно.

Такие же отдельные домены характерны для хромосом эукариот. При лизисе ядер на поверхности градиента сахарозы геном может быть получен в виде компактной структуры. Так, из ядер клеток D. melanogaster, могут быть выделены структуры, состоящие из плотно упакованных фибрилл (диаметром около 10 нм), содержащих ДНК, которая находится в комплексе с белками.

Плотность суперспирализации, измеренная при титровании бромидом этидия, примерно соответствует одному отрицательному супервитку на 200 пн. При обработке ДНКазой эти супервитки удаляются, однако структура 10-нм фибриллы остается. Это позволяет предполагать, что суперспираль представляет собой форму пространственной организации фибриллы, и образование ее обусловлено возникновением скручивающего усилия.

Для полной релаксации суперспирали требуется один разрыв на 85 тпн, что соответствует средней длине «замкнутой» ДНК Эта область может представлять собой петлю или домен, аналогичный обнаруженным в геноме бактериям. После экстракции из митотических хромосом большей части белков эти петли становятся видимыми. Они состоят из ДНК, содержащей примерно 8% исходного количества белка. Как следует из рисунка ниже, частично лишенные белка хромосомы выглядят как структуры, содержащие внутри каркас и окруженные гало ДНК.

Каркас метафазной хромосомы представляет собой плотную сеть фибрилл. От него, в виде петель средней длины, 10-30 мкм (30-90 тпн), распространяются нити ДНК. Эта ДНК может быть удалена при ферментативной обработке без нарушения целостности каркаса, который содержит набор определенных белков. Таким образом, можно предполагать, что ДНК организована в виде петель размером порядка 60 тпн, которые прикреплены к центральному белковому каркасу.

Внешне каркас напоминает митотическую пару сестринских хроматид. Обычно сестринские каркасы тесно примыкают друг к другу, но иногда располагаются раздельно, соединяясь между собой посредством лишь нескольких фибрилл. Могут ли они представлять собой структуры, ответственные за поддержание формы митотических хромосом? Образуется ли каркас при объединении тех белков, которые обычно фиксируют основания петель в интерфазном хромаине?

Хромосома, лишенная гистонов, состоит из белкового каркаса,
к которому присоединены петли ДНК.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Откуда в хромосоме петли

Хромосомные петли, которые помогают компактно уложить огромную молекулу ДНК в клеточном ядре, возникают благодаря белковой «застёжке».

Мы научились читать последовательность ДНК, однако до сих пор плохо представляем себе, как наша двухметровая ДНК укладывается в микроскопическом клеточном ядре. Известно, что геном человека разбит на 46 хромосом (мы говорим о диплоидном хромосомном наборе, то есть когда каждая хромосома представлена материнской и отцовской копиями), и каждая из них представляет собой сложнейший белково-нуклеиновый комплекс, в котором можно выделить несколько уровней компактизации — ДНК многократно сворачивается, сгибается, чтобы занимать как можно меньше места. Сама она свернуться до такой степени не может, ей должны помогать белки гистоны, и взаимодействие её с гистонами на разных этапах укладки до сих пор активно изучается молекулярными биологами. И хотя слово «хромосома» сейчас известно всем, не сказать, чтобы мы полностью представляли, как она устроена.

Год назад мы рассказывали о работе исследователей из Медицинского колледжа Бэйлора, построивших трёхмерную карту человеческого генома, на которой можно было увидеть все петли, изгибы и прочее, если они образованы из не менее чем 1 000 генетических ДНК-«букв». Раньше думали, что человеческая ДНК образует около миллиона петель, но оказалось, что их гораздо меньше — порядка 10 тысяч. У них есть специальная «скрепка», белок CTCF, по молекуле которого сидит на каждой нити в точке их соединения. Такие петли собирались в крупные хромосомные отделы-компартменты, а те, в свою очередь, в ещё более крупные субкомпартменты.

Новая модель вынудила пересмотреть некоторые популярные представления об организации хромосомы. На самом нижнем уровне компактизации нить ДНК наматывается на молекулярные шайбы, сложенные из белков гистонов; как ранее полагали, такие шайбы, называемые нуклеосомами, укладываются в высокоорганизованную нить-фибриллу длиной 30 нанометров. Со временем стали накапливаться данные о том, что в реальности, в живой клетке ДНК организована не так жёстко, однако только вот такой пересчёт петель прямо показал, что 30-нанометровые фибриллы, если и существуют, то лишь на определённых этапах жизни клетки.

Как формируются петли? Учитывая, что белок CTCF служит им застёжкой, и что у него есть специальные места связывания в ДНК, можно было бы предположить, что пара CTCF сразу садится на эти участки, а ДНК просто протягивается через белковый комплекс, подобно тому, как мы протягиваем через узел шнурок на ботинке. Однако модель, которую те же авторы вместе с коллегами из Университета Райса, Стэнфорда и Института Броудов предлагают в своей новой статье, выглядит иначе: в ней уже сформировавшийся комплекс из двух молекул белка садится на любой участок ДНК, после чего нить нуклеиновой кислоты начинает протягиваться через «скрепку». ДНК-петля растёт до тех пор, пока не белки CTCF не встретят в ней свои последовательности, с которыми они прочно связываются. То есть выпетливание идёт до тех пор, пока не сработает «застёжка», а сработает она тогда, когда встретятся оба её компонента: белковый комплекс и определённая последовательность нуклеотидов, которую эти белки «любят».

Формирование ДНК-петель моделировали на компьютере. Однако, во-первых, она согласуется с ранее полученными экспериментальными данными, в том числе и относительно поведения белка CTCF. Во-вторых, с её помощью удалось предсказать результаты новых опытов, в которых из ДНК либо удаляли, либо добавляли последовательности связывания с CTCF, после чего анализировали изменения в укладке цепи нуклеиновой кислоты – исчезновение и появление пространственных структур в ДНК было таким, какое показывала модель.

Запетливание ДНК нужно не только для того, чтобы её можно было компактнее уложить. В геноме есть специальные регуляторные области, называемые промоторами и энхансерами, которые нужны для управления транскрипцией, синтезом РНК на ДНК. Промоторы и энхансеры связываются с особыми белками, с помощью которых и влияют на активность генов. Энхансеры обычно действуют на промоторы, однако давно было замечено, что они находятся довольно далеко от тех последовательностей, с которыми работают. Но это если представлять ДНК в виде прямой нити – в свете новых данных становится понятно, как регуляторные участки ДНК могут управлять работой далеко отстоящих от них генов.
Также очевидно, что механизм запетливания хромосомы сам по себе играет роль одного из важнейших механизмов регуляции генетической активности.

Теперь исследователям предстоит понять, как такие петли и белок CTCF взаимодействуют с молекулярными машинами ремонта ДНК, её удвоения и синтеза РНК.

Домены ДНК, красный и синий, удерживаемые застёжкой из белков CTCF (жёлтым). (Иллюстрация Rice University.)

Классификация факторов транскрипции

Ниже будут подробнее рассмотрены особенности структуры некоторых наиболее часто встречающихся структурно-функциональных доменов факторов транскрипции и механизмы их регуляторного действия на транскрипцию генов.

Факторы транскрипции в роли позитивных регуляторов (активаторов) синтеза РНК. Изучение механизмов функционирования белковых факторов транскрипции – задача непростая. Прежде всего, это связано с их малой концентрацией в клетках и большими сложностями получения факторов в очищенном состоянии для дальнейших биохимических исследований. Развитие генно-инженерных методов позволило получать факторы транскрипции в неограниченных количествах, что не замедлило принести плоды в виде новой информации (подробнее о методах клонирования генов см. в главе 7).

Для того чтобы фактор транскрипции оказал специфическое действие на синтез РНК определенным геном, он, прежде всего, должен распознать этот ген и связаться с определенной последовательностью ДНК. Затем фактор транскрипции должен взаимодействовать с другими факторами или непосредственно с самой РНК-полимеразой для стимуляции или подавления транскрипции на этом гене. Кроме того, необходимость включения и выключения транскрипции в строго определенных месте и времени (тканеспецифический характер экспрессии генов на разных стадиях онтогенеза организма) предполагает наличие механизмов контроля биосинтеза или активации самих факторов транскрипции для упорядочивания их функционирования. Ниже будут рассмотрены механизмы, обеспечивающие эти три этапа функционирования факторов транскрипции – связывание с ДНК, влияние на процесс транскрипции и регуляция их собственной активности.

Механизмы взаимодействия факторов транскрипции с ДНК. Клонирование генов факторов транскрипции (и их фрагментов), а также выделение соответствующих рекомбинантных белков позволили идентифицировать участки их полипептидных цепей, обеспечивающие специфическое взаимодействие факторов с ДНК. Очищенные фрагменты белков были исследованы на способность взаимодействовать с определенными последовательностями ДНК. Это позволило обнаружить несколько структурных элементов (доменов) полипептидных цепей, общих для факторов транскрипции разных типов, которые легли в основу их современной классификации.

Рис. I.24. Особенности структуры полипептидных доменов типа "цинковые пальцы" и их взаимодействие с ДНК

а – схема строения домена, содержащего Zn-связывающие остатки Cys (C) и Hys (H); б – предполагаемый механизм взаимодействия доменов типа "цинковые пальцы", изображенных в виде цилиндров, с ДНК. Стрелки указывают полярность цепей ДНК 5’®3’; в – схема строения доменов типа "цинковые пальцы", содержащих только Zn-связывающие остатки Cys. Квадратными скобками отмечены участки полипептидных цепей, участвующие в распознавании палиндромных последовательностей ДНК (А и Б)

Домены типа "цинковые пальцы". Одним из первых факторов транскрипции, полученных в виде очищенного рекомбинантного белка, был фактор TFIIIA, который играет ключевую роль в транскрипции генов 5S рРНК РНК-полимеразой III. ДНК-связывающий участок полипептидной цепи этого фактора содержит девять 30-звенных повторов: Tyr/Phe-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa_2,4-Cys-Xaa₃-Phe-Xaa₅-Leu-Xaa₂-His-Xaa_3,4-His-Xaa₅, где Xaa – остаток любой аминокислоты. Таким образом, каждый из повторов содержит две строго консервативные пары остатков Cys и His, которые взаимодействуют с одним ионом цинка. Это приводит к образованию в свернутой полипептидной цепи пространственной структуры, сформированной консервативными остатками Phe, Leu и несколькими остатками основных аминокислот. Структура выступает над поверхностью белковой глобулы в виде "пальца" (рис. I.24,а). Вершины пальцев непосредственно контактируют с большой бороздкой ДНК, причем соседние пальцеобразные структуры связываются противоположными сторонами спирали ДНК (см. рис. I.24,б).

Домены типа "цинковые пальцы" обнаружены у многих факторов транскрипции, обеспечивающих функционирование РНК-полимеразы II, в том числе у фактора Sp1, Kruppel-белка Drosophila, белков ADRI и GAL4 дрожжей и белка аденовируса E1A. Интересно, что точковая мутация в гене Kruppel-белка, приводящая к замене лишь одного из остатков Cys на Ser, что, в свою очередь, предотвращает связывание иона Zn 2+ , фенотипически проявляется как делеция целого гена этого фактора. На данном основании был сделан вывод о том, что способность связывать ионы Zn 2+ является критической для проявления ДНК-связывающей активности факторов такого типа.

Аналогичные домены обнаружены в полипептидных цепях семейства рецепторов тиреоидных или стероидных гормонов, которые в комплексе с гормонами после переноса в ядра специфически взаимодействуют с определенными последовательностями ДНК, изменяя уровни транскрипции соответствующих генов-мишеней. Однако в этом случае ДНК-связывающие участки состоят из двух пальцев, каждый из которых содержит четыре остатка Cys, взаимодействующие с ионом Zn 2+ _, вместо двух Cys и двух His (см. рис. I.24,в); у них также отсутствуют консервативные остатки Phe и Leu. Кроме того, элемент из двух цинковых пальцев встречается в полипептидных цепях таких рецепторов только один раз, тогда как в генах, кодирующих цинковые пальцы с Cys–His, подобный элемент может повторяться от 2 до 37 раз.

Исследование мест связывания различных рецепторов стероидных гормонов с ДНК показало, что они взаимодействуют с гомологичными, но не идентичными регуляторными последовательностями нуклеотидов (подчеркнуты):

Глюкокортикоиды/прогестерон	GGTACANNNTGTTCT
Эстрогены	AGGTCANNNTGACCT
Тиреоидные гормоны/ретиноевая кислота	TCAGGTCA---TGACCTGA,

где N – любые нуклеотиды, --- – отсутствие нуклеотидов.

Методами направленного мутагенеза установлено, что специфичность взаимодействия этих рецепторов со своими последовательностями определяется небольшим числом аминокислотных остатков. Так, замена всего лишь двух аминокислотных остатков в N-концевой части цинкового пальца рецептора глюкокортикоидов на аминокислотные остатки, обнаруживаемые в том же самом участке рецептора эстрогенов, приводит к тому, что мутантный рецептор начинает взаимодействовать с регуляторными последовательностями, узнаваемыми рецепторами эстрогенов, и активировать гены, контролируемые этими последовательностями. Аналогичные замены пяти аминокислотных остатков во втором пальце рецептора эстрогенов также приводят к изменению его специфичности: он приобретает способность взаимодействовать с регуляторной последовательностью тиреоидных гормонов. Как уже упоминалось выше, оба рецептора узнают одни и те же последовательности нуклеотидов, различающиеся лишь расстояниями между ними. При этом первый цинковый палец играет ключевую роль в узнавании последовательности как таковой, а второй определяет оптимальное для взаимодействия расстояние между двумя половинками этой последовательности.

Факторы транскрипции, содержащие мотив "спираль–поворот–спираль".Другой тип пептидных доменов, специфически распознающих регуляторные последовательности на ДНК, характерен для белковых продуктов гомеотических (гомеозисных) генов, впервые обнаруженных у дрозофилы. Гомеотические гены позвоночных и растений играют ключевую роль в их морфогенезе. Полипептидные цепи белков, кодируемых этими генами, содержат высококонсервативную последовательность длиной в 60 аминокислотных остатков, называемую гомеобоксом, или гомеодоменом, которая определяет специфичность взаимодействия белков с регуляторными последовательностями ДНК. Анализ третичной структуры гомеодоменов показал, что они образуют структуру типа "спираль–поворот–спираль" (helix–turn–helix), в которой за a-спиральным участком следует b-структура с последующим еще одним a-спиральным участком (рис. I.25,а). Наличие этой пространственной структуры, существование которой было впервые предсказано на основании гомологии с соответствующими аминокислотными последовательностями бактериальных белков-репрессоров, в настоящее время строго доказано методами ЯМР-спектроскопии, в частности для гомеодомена продукта гена Antennapedia дрозофилы.

Рис. I.25. Структуры полипептидных доменов типа "спираль–поворот–спираль" (а) и "лейциновая застежка" (б)

Для бактериальных белков-репрессоров было показано, что при образовании специфических комплексов с ДНК первый a-спиральный участок расположен перпендикулярно большой бороздке ДНК, тогда как второй частично находится в ней и обеспечивает специфические контакты репрессора с операторным участком ДНК. Ключевая роль второго a-спирального участка гомеодомена при изучении специфичности взаимодействия этих белков с ДНК была определена с помощью мутаций. Так, замена только одного остатка Ser в положении 9 a-спирали белка Prd на Gln, присутствующий в гомеозисном белке Ftz, приводит к связыванию белка Prd с Ftz-сайтами на ДНК.

Позднее была обнаружена большая группа регуляторных белков, в которых гомеобоксы формируют лишь одну часть более протяженного консервативного домена, названного POU-доменом. Эти белки, к которым относятся, в частности, октамерсвязывающие белки (octamer binding proteins) Oct-1 и Oct-2, белок гипофиза Pit-1 и продукт гена unc-86 нематод, используют POU-домены для специфического взаимодействия с ДНК. Относительный вклад аминокислотной последовательности гомеобокса и негомебоксной POU-последовательности в специфичность связывания белок-ДНК не одинаков для разных белков. Так, в белке Pit-1 специфичность в основном достигается за счет гомеодомена, тогда как в белке Oct-1 основную роль играет другая последовательность POU-домена.

ДНК-связывающий домен типа "лейциновая застежка". Сравнение аминокислотных последовательностей ряда других факторов транскрипции: фактора транскрипции печени C/EBP, дрожжевого фактора GCN4, а также белков-продуктов протоонкогенов Myc, Fos и Jun (протоонкогены – это гены, мутации в которых могут приводить к злокачественному перерождению клеток), позволило выявить еще одну консервативную аминокислотную последовательность, образующую пространственную структуру, названную "лейциновой застежкой" (leucine zipper). В этой структуре остатки Leu, находящиеся в составе a-спирального участка полипептидных цепей факторов, расположены через каждые шесть аминокислотных остатков на равном расстоянии друг от друга и оказываются на одной стороне a-спирали через каждые два витка (см. рис. I.25,б). Такие домены сами по себе не связываются с ДНК, однако обеспечивают димеризацию содержащих их факторов путем взаимопроникновения лейциновых a-спиралей двух молекул факторов. В результате в димере появляются две правильно расположенные друг относительно друга полипептидные цепи, составленные преимущественно из основных аминокислотных остатков, которые и образуют ДНК-связывающий центр фактора транскрипции.

Димеры белков Fos и Jun связываются с Ap-1-последовательностями ДНК, что сопровождается активацией соответствующих генов в ответ на воздействие форболовыми эфирами. Однако если белок Jun связывается с Ap-1-последовательностями нуклеотидов в виде гомодимера (белкового комплекса, состоящего из двух идентичных полипептидных цепей), то белок Fos специфически взаимодействует с ДНК только после образования комплекса (гетеродимера) с белком Jun. Эти свойства двух белков являются следствием различий в структуре их лейциновых доменов, которые не позволяют образовываться гомодимеру из полипептидных цепей Fos. Искусственная замена лейцинового домена Fos на соответствующий домен белка Jun обеспечивает условия для получения гомодимера из таких химерных полипептидных цепей. Необходимость образования димера этих двух регуляторных белков перед взаимодействием с ДНК создает дополнительную возможность воздействия на экспрессию соответствующих генов путем контроля над формированием самого белкового комплекса фактора транскрипции.

Основной ДНК-связывающий домен, впервые обнаруженный у белков, содержащих "лейциновую застежку", позднее был найден и у ряда других белков, регулирующих транскрипцию, в частности у двух белков E12 и E47, которые взаимодействуют с энхансерами иммуноглобулиновых генов, у регуляторного белка мышц MyoD1 и у некоторых белков дрозофилы. Однако в этих случаях основной домен расположен по соседству с участком полипептидной цепи, образующим домен типа "спираль–поворот–спираль", в котором две амфипатические спирали (содержащие все заряженные аминокислотные остатки на одной стороне спирали) разделены неспирализованной петлей. Предполагают, что такой домен играет ту же роль в димеризации полипептидных цепей и формировании ДНК-связывающего центра, что и описанные выше регуляторные полипептиды, содержащие лейциновые домены.

Следует еще раз подчеркнуть, что структуры типа "лейциновая застежка" и "спираль–поворот–спираль" необходимы для димеризации полипептидных цепей транскрипционных факторов, принадлежащих к данной группе, что сопровождается формированием основного ДНК-связывающего участка регуляторных белков. Белок протоонкогена myc содержит как лейциновый домен, так и домен типа "спираль–поворот–спираль" по соседству с основным ДНК-связывающим доменом. В соответствии с этим все данное семейство регуляторных белков можно разделить на подсемейства, в которых полипептидные цепи факторов транскрипции содержат порознь или одновременно домены типа "лейциновая застежка" или "спираль–поворот–спираль".

Таковы особенности структуры некоторых наиболее хорошо изученных доменов факторов транскрипции, обеспечивающих специфичность взаимодействия последних с регуляторными последовательностями ДНК, что необходимо для их регуляторного воздействия на транскрипцию соответствующих генов. Количество известных доменов у факторов транскрипции быстро возрастает с развитием исследований в этой области. Так, новые ДНК-связывающие участки полипептидных цепей недавно обнаружены у фактора транскрипции AP2, факторов, обеспечивающих регуляторное действие сыворотки, белков CTF/NTF, взаимодействующих с CAAT-боксом, факторов транскрипции дрожжей HAP-2 и HAP-3. В белках существует несколько структур, обеспечивающих специфическое распознавание определенных последовательностей ДНК, что позволяет осуществлять передачу регуляторных сигналов к определенным генам-мишеням и служит основой для обеспечения их дифференциальной экспрессии на уровне транскрипции. Данные о некоторых наиболее важных с функциональной точки зрения доменах факторов транскрипции суммированы в табл. I.14.

Несмотря на то что специфическое связывание с ДНК является обязательным этапом для регуляторного воздействия белковых факторов на транскрипцию, реализация активности факторов часто требует их специфического взаимодействия с другими регуляторными белками, а также с самой РНК-полимеразой II. Большинство таких воздействий приводит к активации транскрипции. Однако результатом некоторых из них может быть и репрессия синтеза мРНК. Ниже будут рассмотрены условия, необходимые для осуществления позитивного действия факторов транскрипции.

Для идентификации участков полипептидных цепей факторов транскрипции, непосредственно участвующих в активации синтеза РНК, чаще всего конструируют химерные рекомбинантные белки (некоторые из них кратко описаны выше), объединяющие в одной цепи ДНК-связывающий домен и участки полипептидных цепей других факторов, и изучают влияние таких гибридных факторов на транскрипцию in vitro. В ходе исследований, основанных на подобных подходах, были идентифицированы функциональные домены факторов транскрипции, в том числе домены, участвующие в активации транскрипции, которые, как правило, отличаются от ДНК-связывающих участков их полипептидных цепей. Доменную структуру факторов транскрипции можно проиллюстрировать на примере семейства рецепторов стероидных/тиреоидных гормонов (рис. I.26). В полипептидной цепи таких факторов четко видны три функциональных модуля: ДНК-

Рис. I.26. Доменная структура полипептидной цепи рецептора глюкокортикоидов

Цифрами указаны номера аминокислотных остатков на границах функциональных доменов, участвующих в активации транскрипции, связывании ДНК и гормона

Читайте также: