Систематика бактерий. Окраска по Граму. Грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии. Кислотоустойчивые бактерии.

Обновлено: 27.03.2024

ОБЩАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
КЛАССИФИКАЦИЯ И
МОРФОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
ФИЗИОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
ИММУНОЛОГИЯ
ЧАСТНАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
ЧАСТНАЯ
БАКТЕРИОЛОГИЯ
I часть
ЧАСТНАЯ
БАКТЕРИОЛОГИЯ II
часть
ЧАСТНАЯ
ВИРУСОЛОГИЯ

2. 1904 г. – Бактериологический институт

4. Иван и Зинаида Чурины

13. Кафедра микробиологии и вирусологии СибГМУ

14. МИКРОБИОЛОГИЯ

ОБЩАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
КЛАССИФИКАЦИЯ И
МОРФОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
ФИЗИОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
ИММУНОЛОГИЯ
ЧАСТНАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
ЧАСТНАЯ
БАКТЕРИОЛОГИЯ
I часть
ЧАСТНАЯ
БАКТЕРИОЛОГИЯ II
часть
ЧАСТНАЯ
ВИРУСОЛОГИЯ

15. Классификация и строение микроорганизмов

Mundus microbiorum:
(Мир микробов)
Эукариоты
(Eucaria)
Грибки (Fungi)
Простейшие (Protista)
Растения (Plantae)
Животные (Animalia)
Прокариоты
Археи (Archaea)
Бактерии (Bacteria)
Акариоты
Вирусы (Vira)

19. Классификация микроорганизмов

1923 г. – американское общество
бактериологов издало первый
международный «Определитель
бактерий» под редакцией Д. Берджи.
Комитет Bergey's Manual Trust:
«Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology» – идентификация;
«Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology» – систематика.

Определитель бактерий Берджи (1994):
1. Gracilicutes – токостенные,
грамотрицательные (1 – 16 группы);
2. Firmicutes – толстостенные,
грамположительные (17 – 29);
3. Tenericutes – лишены клеточной
стенки (30-ая группа);
4. Mendosicutes – архебактерии (стенки
лишены пептидогликана, имеются
особенности строения рибосом,
мембраны и РНК – 31 – 35 группы).

21. Систематика микроорганизмов

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology
(2001) отражает филогенетическое
родство.
Микроорганизмы систематизированы по:
● фенотипическим признакам;
● генотипическим признакам;
● филогенетическим признакам
(секвенирование 16S и 23S рРНК, анализ
рРНК-нуклеотидных
последовательностей).

22. Таксоны классификации Bergey

Царство – regnum (лат.);
домен – domen (лат.);
филум – phylum (лат.);
класс – class (лат.);
порядок – ordo (лат.);
семейство – familia (лат.);
род – genus (лат.);
вид – species (лат.).

Вид – это эволюционно сложившаяся
совокупность особей, имеющих единый
тип организации, который в стандартных
условиях проявляется сходными
фенотипическими признаками:
морфологическими, физиологическими,
биохимическими и др.
Бинарная номенклатура :
Escherichia coli (E. coli)
Staphylococcus aureus (S.aureus).

24. Таксономическая схема бактерий, имеющих медицинское значение (Domain Bacteria)

Phylum
Proteobacteria
Class
"Alphaproteobacteria"
Order
Rickettsiales
Family
Genus
Rickettsiaceae
Rickettsia
Ehrlichiaceae
Ehrlichia
Anaplasma
"Betaproteobacteria"
"Gammaproteobacteria"
"Rhizobiales"
Brucellaceae
Brucella
"Burkholderiales"
Alcaligenaceae
Bordetella
"Neisseriales"
Neisseriaceae
Neisseria
"Thiotrichales"
"Francisellaceae"
Francisella
"Legionellales"
Legionellaceae
Legionella
"Coxiellaceae"
Coxiella
Pseudomonadales
Pseudomonadaceae
Pseudomonas
"Vibrionales"
Vibrionaceae
Vibrio
"Enterobacteriales"
Enterobacteriaceae
Escherichia
Klebsiella
Proteus
Salmonella
Shigella
Yersinia
"Epsilonproteobacteria"
"Campylobacterales"
Campylobacteraceae
Campylobacter
"Helicobacteraceae
Helicobacter

Firmicutes
"Clostridia"
Clostridiales
Clostridiaceae
Clostridium
Sarcina
Mollicutes
Mycoplasmatales
Mycoplasmataceae
Mycoplasma
Ureaplasma
"Bacilli"
Bacillales
Bacillaceae
Bacillus
"Staphylococcaceae"
Staphylococcus
"Enterococcaceae"
Enterococcus
Streptococcaceae
Streptococcus
Order
Actinomycetales
Suborder
Actinomycineae
Actinomycetaceae
Actinomyces
Suborder
Micrococcineae
Micrococcacea
Micrococcus
Suborder
Corynebacterineae
Corynebacteriaceae
Corynebacterium
Mycobacteriaceae
Mycobacterium
Nocardiaceae
Nocardia
Suborder
Streptomycineae
Streptomycetaceae
Streptomyces
Order
Bifidobacteriales
Bifidobacteriaceae
Bifidobacterium
Chlamydiales
Chlamydiaceae
Clamydia
"Lactobacillales"
Actinobacteria
Chlamydiae
Class
Actinobacteria
Subclass
Actinobacteridae
"Chlamydiae"
Chlamydophila
Spirochaetes
"Spirochaetes"
Spirochaetales
Spirochaetaceae
Borrelia
Treponema
Leptospiraceae
Leptospira

27. Внутривидовые варианты

штамм – популяция бактерий, выделенных из одного
источника;
клон – популяция бактерий, полученная из одной
бактериальной клетки;
морфовары (типы) – варианты, отличающиеся от
основного вида по морфологическим свойствам;
хемовары – по биохимическим свойствам;
серовары – по антигенной структуре;
резистовары – по чувствительности к АБ;
фаговары – по чувствительности к бактериофагам;
геновары – по строению части генома;
биовары – по нескольким биологическим свойствам.

29. Морфология микроорганизмов

30. Кокковидные микроорганизмы

31. Палочковидные микроорганизмы

32. Извитые микроорганизмы

33. Нитевидные микроорганизмы

34. Отличия прокариот и эукариот

35. Отличия прокариот и эукариот

Признак
Оформленное ядро
Размеры клеток
Наличие митохондрий,
хлоропластов,
аппарата Гольджи,
лизосом, ЭПР
Локализация рибосом
КС рибосом
Прокариоты
Эукариоты

+
0,2-2,0 мкм
>2,0 мкм

+
Рассеяны в
цитоплазме
Прикреплены к
ЭПР
70S
80S
фибрилла
9+2
Митоз

+
Число хромосом
1
Обычно>1
Кольцевая
Линейная
Структура жгутика
Хромосома

36. Анатомия бактериальной клетки

37. Анатомия бактериальной клетки

Постоянные
компоненты
клеточная стенка,
ЦПМ,
цитоплазма,
рибосомы,
мезосомы,
генофор
Непостоянные
компоненты
капсула,
жгутики,
пили,
споры,
включения,
плазмиды

38. Клеточная стенка

XIX в. – Христиан Грам
предложил
дифференциальную
окраску → бактерии
грамположительные
грамотрицательные

39. Пептидогликан

Муреин (мукопептид,
гликопептид);
Гликан: остатки Nацетилглюкозамина и
N-ацетилмурамовой
кислоты, соединенные
гликозидной связью.
Транспептидазы (ПСБ);
Г+ 40 слоев, 50 нм и
более, до 90% сухой
массы КС;
Г- 1-2 слоя, 15-20 нм,
около 10% КС.
Г+
Г–

40. Г+ бактерии

41. Г- бактерии

наружная мембрана;
липополисахарид (ЛПС):
● липид А – эндотоксин;
● ядро (базис) – полисахарид, включающий
глюкозу, галактозу, N-ацетилглюкозамин и
кетодезоксиоктонат (КДО);
● О-специфическая цепь олигосахаридных
последовательностей (галактоза, манноза,
рамноза, N-ацетилглюкозамин, абеквоза,
колитоза, тивелоза и др.). О-антиген.

42. Порины

Белки массой до 700, окаймляют
гидрофильные поры, обеспечивают
диффузию химических веществ в
микробную клетку.
Функции: метаболизм, конъюгация.
Порины I (полностью пронизывают КС), II
(прерываются в периплазматическом
пространстве) и III порядка (имеют
вставочный белок).
Г+ – порины I и III порядка;
Г– – порины I и II порядка.

43. Клеточная стенка

44. Клеточная стенка

45. Функции клеточной стенки

придает форму;
защитная;
содержит рецепторы для фагов, колицинов,
химических соединений;
антигенная;
транспорт веществ;
постоянство внутренней среды;
определяет способность бактерий
воспринимать красители (тинкториальные
свойства).

46. Принцип окраски по Граму

Грамположительные бактерии
удерживают генциановый
фиолетовый в комплексе с йодом
– фиолетовая окраска бактерий;
Грамотрицательные бактерии
после воздействия спирта
утрачивают краситель,
обесцвечиваются и при обработке
фуксином окрашиваются в
красный цвет.

Фирмикутные ( толстостенные,
грамположительные):
большинство кокков (пневмококки,
стрептококки, стафилококки,
сарцины), палочки (бациллы,
клостридии, коринебактерии,
микобактерии, бифидобактерии),
ветвящиеся бактерии –
актиномицеты.
Грациликутные (тонкостенные,
грамотрицательные): извитые
формы, спирохеты и спириллы,
разнообразные палочки,
вибрионы, хеликобактерии, кокки
(нейссерии), риккетсии и
хламидии.

48. Кислотоустойчивые бактерии

Г+ с высоким содержанием жирных
кислот (туберкулостеариновая,
миколовая и др.), восков,
фосфолипидов → прочность,
устойчивость к кислотам и щелочам.
Mycobacterium tuberculosis.
Метод Циля-Нильсена:
кислотоустойчивые бактерии не
обесцвечиваются кислотой и
остаются рубиново красными, а
кислотонеустойчивые –
обесцвечиваются и докрашиваются
метиленовым синим в синий цвет.

49. Бактерии, лишенные КС

50. ЦПМ

– липопротеин: 15-30%
липиды, 50-70% протеины
(структурные и функциональные),
2-5% углеводы и РНК.
ЭМ: трехслойная мембрана.
ЦПМ – мобильная текучая
структура.
Функции ЦПМ: регуляция
поступления в клетку
метаболитов и ионов, регуляция
осмотического давления,
транспорт веществ и
энергетический метаболизм
клетки, репликация ДНК,
спорообразование.
ЦПМ

51. Мезосомы

52. Цитоплазма

Коллоидная система: вода
(около 75%), минеральные
вещества, ферменты,
растворимые белки, РНК,
включения и рибосомы.
Включения: гранулы
гликогена, полисахариды,
полифосфатов (волютина).
Волютин обладает
метахромазией (метод
Нейссера).

53. Рибосомы

Рибосомы: размер около
20 нм, две субъединицы (50 S и 30 S). Перед
началом синтеза белка – объединение в 70S. Не
объединены в эндоплазматическую сеть.
Рибосомные РНК (рРНК) – консервативные
элементы бактерий («молекулярные часы»
эволюции). 16S рРНК – малая субъединица, а
23S – большая. 16S рРНК – геносистематика
(степень родства организмов).
В зависимости от интенсивности роста – от 5000
до 50000 рибосом.

54. Генетическая система бактерий

Нуклеоид (генофор) –
бактериальная хромосома
(двунитевая
суперспирализованная ДНК
кольцевой формы), содержит
до 4000 отдельных генов.
Выявление: по Фельгену, по
Романовскому-Гимзе, ЭМ.
Плазмиды – ковалентно
замкнутые кольцевые
двунитевые ДНК размером от
106 до 108 Д, от 40 до 50
генов. Количество – от 1 до
200.
Эписомы и интегрированные
плазмиды.
Функции: регуляторные,
кодирующие
(экзотоксины, ферменты,
бактериоцины,
устойчивость к
лекарственным
препаратам и т.д.).

55. Споры

56. Споры

Форма, размер и
расположение спор –
видовое свойство бактерии.
Выявление: при обычном
окрашивании и по методу
Ожешко (спора
прокрашивается в рубиново
красный цвет карболовым
фуксином, а вегетативная
клетка после
обесцвечивания кислотой
докрашивается
метиленовым синим).

57. Капсула

Капсула – слизистая структура
толщиной более 0,2 мкм;
Состав: полисахариды и
полипептиды (мономеры Dглутаминовой кислоты).
Капсула гидрофильна,
препятствует фагоцитозу
бактерий.
Функции капсулы: защитные,
адгезивные, патогенные и
антигенные.
Выявление: негативное
контрастирование по БурриГинсу;

58. Капсула

Микрокапсула –
слизистое образование
толщиной менее 0,2 мкм,
выявляемое при ЭМ.
Слизистый чехол
(гликокаликс) –
мукоидные
полисахариды, не
имеющие четких внешних
границ и не имеет связи с
клеточной стенкой.
S-слои
– равномерно
упакованные белковые
структуры на
поверхности клеточной
стенки.

59. Жгутики

Жгутики – толщина 12-20 нм, длина 3-12 мкм.
Флагеллин (от. лат. flagellum – жгутик), антигенная
специфичность.
Хемомеханический преобразователь
(флагеллиновый мотор).

60. Движение жгутика

61. Жгутики

62. Жгутики

63. Жгутики

Хемотаксис, аэротаксис,
фототаксис.
Скорость движения
бактерий: Bacillus
megaterium – 27 мкм/с, V.
cholerae – 200 мкм/с.
Выявление: ЭМ, по
Леффлеру,
серебрением, при
помощи фазовоконтрастной или
световой микроскопии
«раздавленной» или
«висячей» капли.

64. Пили

Пили (ворсинки, фимбрии от
англ. fimbria – бахрома) –
тонкие полые нити белковой
природы (3-10 нм х 0,3-10 мкм).
Пилин, антигенная активность.
Пили 1-го или общего типа –
common pili: адгезия, их много,
снижают заряд бактерии и
уменьшают электростатические
силы отталкивания, увеличение
площади поверхности
бактериальной клетки →
утилизация питательных
веществ.

65. Пили

Пили 2 типа (половые,
F-пили, конъюгативные
– sex pili): конъюгация
бактерий, имеются
только у бактерийдоноров (1-4 на клетку),
более длинные (0,5-10
мкм).
Взаимодействие с
«мужскими»
сферическими
бактериофагами.

Окрашивание бактерий по Граму


Окрашивание бактерий по Граму – метод окраски, позволяющий разделить данную группу прокариотичеких микроорганизмов на грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии [2] .


Окрашивание в фиолетовый цвет
грамположительной бактерии Bacillus thuringiensis


Грамотрицательные и грамположительные бактерии отличаются строением клеточной стенки. Метод окрашивания бактерий по Граму был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом [2] . К грамотрицательным бактериям, в частности, относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, семейство Псевдомонадовые (Pseudomonadaceae).

Основы и сущность метода

Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий [2] [1] .

Как уже было указано, все бактерии по этому признаку делят на две группы:

  • грамположительные – красящиеся по Граму;
  • грамотрицательные – не красящиеся по Граму [1] .

Техника окрашивания бактерий по Граму

Методика поверки бактерий на окрашивание по Граму включает следующие операции:

  1. На обезжиренное предметное стекло наносят в трех местах три капли воды и готовят три тонких мазка различных видовбактерий. При этом по краям располагают контрольные мазки с заведомо известным отношением к окраске по Граму. В центре – мазок исследуемой культуры [1] .
  2. Мазки высушивают и фиксируют в пламени спиртовки [1] .
  3. Мазки окрашивают в течение одной минуты генцианвиолентом. Для этого на предметное стекло кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смачивают ее водой [1] .
  4. Бумажку с красителем удаляют, на препарат наносят раствор Люголя (водой промывать не надо) и выдерживают 60 секунд, до полного почернения мазка [1] .
  5. Не промывая водой, препарат обрабатывают 96% спиртом в течение 15–20 с. При этом предметное стекло покачивают. Важно четко соблюдать указанное время обесцвечивания, поскольку при увеличении его продолжительности наблюдается обесцвечивание и грамположительных бактерий[1] .
  6. Препарат промывают водой и накладывают на его поверхность полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 60 секунд [1] .
  7. Фильтровальную бумагу с красителем удаляют, препарат промывают водой и осушают чистой фильтровальной бумагой [1] .
  8. На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом [1] .

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные – в красный [3] [1] .

Систематика бактерий. Окраска по Граму. Грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии. Кислотоустойчивые бактерии.

Структура бактериальной клетки

Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядерного аппарата, называемого нуклеоидом. Имеются другие структуры: мезосома, хроматофоры, тилакоиды, вакуоли, включения полисахаридов, жировые капельки, капсула (микрокапсула, слизь), жгутики, пили. Некоторые бактерии способны образовывать споры.
Структуру и морфологию бактерий изучают с помощью различных методов микроскопии: световой, фазово-контрастной, интерференционной, темнопольной, люминесцентной и электронной.

Обозначения:


Клеточная стенка

В клеточной стенки грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40—90% массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид (ЛПС). Липополисахарид наружной мембраны состоит из трех фрагментов: липида А - консервативной структуры, практически одинаковой у грамотрицательных бактерий; ядра, или стержневой, коровой части (лат. core — ядро), относительно консервативной олигосахаридной структуры (наиболее постоянной частью ядра ЛПС является кетодезоксиоктоновая кислота); высоковариабельнои О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями (О-антиген). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы.
При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима,
пенициллина, защитных факторов организма образуются клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты - бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами.
Они представляют собой осмотически чувствительные, шаровидные, колбовидные клетки различной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, «возвращаясь» в исходную бактериальную клетку.
Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, бета-лактомазы) и компоненты транспортных систем.

Цитоплазматическая мембрана


Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм разделены светлым - промежуточным). По структуре она похожа на плазмалемму клеток животных и состоит из двойного слоя фосфолипидов с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутрицитоплазматическими мембранами.

Цитоплазма


Цитоплазма состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул — рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 80S-рибосом, характерных для эукариотических клеток. Рибосомные РНК (рРНК) - консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S рРНК - в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.
В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они являются запасными веществами для питания и энергетических потребностей бактерий. Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки.

Нуклеоид


Нуклеоид — эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.
Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности - плазмиды, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Капсула, микрокапсула, слизь

Капсула - слизистая структура толщиной более 0,2мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка (например, по Бурри-Гинсу), создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов, например, у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы).
Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование толщиной менее 0,2мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слиэь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких границ. Слизь растворима в воде.
Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом. Кроме синтеза
экзополисахаридов бактериями, существует и другой механизм их образования: путем действия внеклеточных ферментов бактерий на дисахариды. В результате этого образуются декстраны и леваны.

Жгутики

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков - у грамположительных и 2 пары дисков - у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Жгутики состоят из белка - флагеллина (от flagellum - жгутик); является Н-антигеном. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали.
Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии (перитрих) у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки.


Пили (фимбрии, ворсинки) - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10нм х 0, 3-10мкм) , чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, то есть за прикрепление бактерий к поражаемой клетке, а также пили, ответственные за питание, водносолевой обмен и половые (F-пили), или конъюгационные пили. Пили многочисленны - несколько сотен на клетку. Однако, половых пилей обычно бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми "мужскими" клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды (F-, R-, Col-плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми "мужскими" сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях.

Споры

Споры - своебразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т.е. бактерий
с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др.. Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют споры, не превышающие диаметр клетки. Бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями, например, бактерии рода Clostridium (лат. Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нильсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.

Форма спор может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке -терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулиэма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы). Спора долго сохраняется из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизмов. В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три последовательные стадии: активация, инициация, прорастание.

obschaya_mikrobiologia_metodicheskie_ukazania

Цель занятия: изучить структурные особенности прокариотических микроорганизмов, овладеть сложными методами окраски для выявления структурных компонентов бактериальной клетки.

1. Классификация микроорганизмов.

2. Ультраструктура бактериальной клетки.

3. Постоянные структурные элементы (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, нуклеоид, цитоплазма, мезосомы, рибосомы), строение, функции, методы выявления.

4. Непостоянные структурные элементы бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки, плазмиды). Строение, функции, методы выявления.

5. Особенности строения клеточной стенки бактерий. Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Окраска по Граму, механизм, значение для классификации бактерий.

6. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Протопласты и сферопласты.

7. Исследование микробов в живом состоянии. Характеристика методов «висячей» и «раздавленной» капли.

8. Сложные методы окраски микроорганизмов.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить мазки из смеси культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, окрасить по Граму, изучить под микроскопом.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по методу Грама . Все бактерии по отношению к окраске по методу Грама делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения клеточной стенки бактерий, ее химического состава.

Техника окраски по методу Грама:

- окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

- бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

- окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

- раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

- тщательно смыть спирт водой;

- окрасить водным фуксином – (2 мин);

- промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а так же высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом.

Техника окраски спор по методу Ожешко:

- нанести несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин);

- слить кислоту, промыть водой, высушить;

- зафиксировать в пламени;

- окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий).

Техника окраски по методу Циля-Нильсена:

- нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров

- бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% раствором серной кислоты

и 3% раствором солянокислого спирта (2–4 с);

- тщательно промыть водой;

- окрасить синькой Леффлера (3–5 мин);

- промыть водой и высушить споры.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а все остальные – синими.

2. Приготовить мазок по методу Бурри-Гинса, промикроскопировать, зарисовать.

Многие виды микроорганизмов обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Техника обнаружения капсул по методу Бурри – Гинса:

- приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить ма-

зок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% этиловый спирт и поджечь);

- окрасить препарат водным фуксином (1–2 мин);

- промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на черно-розовом фоне.

3. Внести основные методы окраски бактериальной клетки (по Граму, Ожешко, Цилю–Нильсену, Бурри–Гинсу, Нейссеру, Романовскому–Гимзе, Здродовскому) в таблицу 1.

Основные методы окраски бактериальной клетки

4. Изучить нативные неокрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют его.

Приготовление препарата “висячая капля”. Его готовят на предмет-

ном стекле с луночкой (углублением):

- края луночки смазывают тонким слоем вазелина;

- культуру микроорганизмов наносят на середину необезжиренного покровного стекла. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут каплю такой культуры, если на плотной, то вначале на покровное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора, а затем бактериологической петлей культуру микробов;

- предметное стекло переворачивают на 180 о и аккуратно накладывают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре луночки;

- готовый препарат переворачивают в прежнее положение.

В таком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере, что позволяет наблюдать за движением микробов длительное время. Препарат рассматривают под микроскопом с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (х8) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. Устанавливают его в центре поля зрения микроскопа. Не сдвигая препарат, переходят на иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму.

Приготовление препарата “раздавленная капля”. Его готовят на предметном стекле: на поверхность предметного стекла наносят каплю 16–24-часовой микробной культуры и раздавливают ее, накладывая покровное стекло. При раздавливании капли нужно избегать образования в ней пу-

зырьков воздуха. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли, опускают, постепенно вытесняя воздух. Если часть жидкости выступает, ее удаляют фильтровальной бумагой.

Препарат “раздавленная капля”, предназначенный для выявления подвижности микроорганизмов, рассматривают под микроскопом с большим увеличением (объектив 40, окуляр 10 или 15, при опущенном конденсоре).

Вопросы для обсуждения

1. Классификация микроорганизмов по Берги. 2. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 3. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 4. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 5. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама. 6. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 7. Техника окраски микробов по методу Грама. 8. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 9. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки, плазмиды). 10. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера–Фултона, Ожешко, Циля–Нильсена, Бурри–Гинса, Нейссера. 11. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 12. Этапы приготовления «висячей» и «раздавленной» капли.

Оформление лабораторной тетради

Заполнить в тетради таблицы 1 и 2; зарисовать микропрепараты из исследуемого материала (окраска по методу Грама и Бурри–Гинсу); зарисовать демонстрационные препараты, а также схематическое строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Различия в окраске по Граму связаны с некоторыми особенностями строения клеточной стенки бактерий. В однослойной клеточной стенке грамположительных микробов имеется несколько рядов пептидогликана (до 80 % от массы клеточной стенки), поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса, образуемого при взаимодействии красителя генцианового фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода, входящего в состав люголя. Также в поверхностном слое клетки находится магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основным красителем – генциановым фиолетовым. Поэтому грамположительные микробы прочно удерживают первый наносимый краситель – генциан-виолет и окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов имеется двуслойная клеточная стенка. Во внутренний слой входят всего один-два ряда пептидогликана. Верхний слой представлен наружной мембраной, включает фосфолипиды, белки и липополисахарид (ЛПС). Отсутствует магниевая соль рибонуклеиновой кислоты. В связи с этим не образуется прочного соединения компонентов клеточной стенки с основным красителем. Они легко обесцвечиваются этиловым спиртом. Поэтому клетки бактерий окрашиваются в цвет последнего наносимого на их поверхность красителя (водный фуксин) – в красный .

Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

Метод Грама


Грамположительная Bacillus anthracis (фиолетовые палочки) в образце спинномозговой жидкости. (Другие клетки — лейкоциты).

Окраска по Граму Staphylococcus aureus (грамположительные кокки) и Escherichia coli (грамотрицательные бациллы)

Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.

По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями (обозначаются Грам (+)), — в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.

После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, который окрашивает все грамотрицательные бактерии в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки. Тест классифицирует бактерии, разделяя их на две группы относительно строения их клеточной стенки

Содержание

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый или малиновый.

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и иодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °C).

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40 % формалин 5 мл, этиловый спирт 96° — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40 % формалина в течение нескольких секунд.

  1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
  1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
  2. Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
  3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
  4. Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
  5. Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
  6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть иода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
  7. Промокают фильтровальной бумагой.
  8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 — 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
  9. Проводят через 3 смены ксилола.
  10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Читайте также: