Скрининг гетерозиготного носительства: показания, эффективность

Обновлено: 18.04.2024

Не идентифицировано 26 13,83

Таким образом, генетически скрипшг о использовании четырех олигонуклеотидных зондов (/Ь^Р. ¿>*-1-1ТС и^!>+-1-б) позволяет диагностировать 79,66 всех мутаций ^ -талассеикя у населения Азербайджана; 6,38? иде нти'ипированн'ых мутация соо-тавлякт - />° 62/83, ^* -30 и ^>*-1-1Э0. Всего иден-ги'ицчрозано всех мутация.

При геногеографич соком исследовании распространения 552 аллелся и р^-) по регионам проживания бальных, учитывали миграцию родителей и место ровдения больного ребенка. Г>но1чог-ра "веское исследованга аллелея -талассемичс ского гена у населения Азербайджана показало их нерззнокгриое распределение о преобладанием клике ^'•"-яллелей, а также »»ояоаллельиым

их распределен ¡ем. Например и регионах: Кабала, Изучала, Кахи, Закатали, "изули, Зардоб, Агддабедн, Нагорная часть Кфчбмуч и Нахичеванская АР встречается только Гераабояг/.ом регионе

а в остальных регионах оба аллелл з разных соотнесениях. Полученные результаты легли в основу наших дальне и с их исследования по составлению молекулярнс-генетическнх карг стации ^-глоб илового гена у населен т Азербайджана.

Все идентифицированные ¡о^ачин Об"1 хромосом) рас предала ни по административно-территориальным, зональный регионам республики, а т-№.'г лз 'пно-территориальному признаку (Таблиц 2,3,

Как видно из таблицы 2, наблюдается неравномерное ро.спрэ-деленке мутация ^г>°8 (-АА) у населени.» .. иинистративннх регионов, обглоуюиих 1С зон.

9 !'!•?: хлюч-.юсеп северные административно-территориальные рая сны, раз иные на Рольаоа Кавказском хребте: Пеки, Закатали, Кахи, Кабала из 22 обследованных хромосом РС хмели иутац;п В другся зоне - в Нагорнся части Карабаха (X). оаополлгтьнсз в горах !Злого Кавказа, кз 1С хрочоггм все 1С (1СС*) имели ">ту (г/тацкю. В семой лольпоя -Кура-Л?: ксп.скоя зоне (3), охватывающей всю нейтральную часть ре спублжк, у обследованных хрг'оссы - 27- имели цутаигэ "0-дона 8 с неравномерным распределением пнутрл золы.

В Гяндте-Казахской зоне (П) нз 16 идентифицированных '^ута-3 имели - ''та мутация не выявлена в Апсгроысксл (I), Ленкорань-АстаринскоП (У) зонах. Наиболее высок кз частоты - 65 из 88 идентифицированных (35,112) ииели делен!» Двух нуклеоги-

дов (-АА) в кодоне 8 jb-глобинового гена. Называется нутация -турецкой, потону, что впервые эта мутация выявлена у турка, а затем спорадически в тех регионах средиземноморского бассейна, которые несколько веков были под игой Османской Империи. Популя-ционные исследования в 1Урции показали, что данная мутация имеет частоту - 6,55/? и значгаельно уступает нашим результатам - 35,IIi. Можно высказать гипотезу о том, что этот ген в турецкую популяцию попал из Азербайджана.

Вторая по чс.стоте встречаемости мутация - замена нуклеотида Г-А в первом пукле отиде второго большого интрона и составляет -22,в7% (43 хромосом из 188).

Как видно из таблиц 3, мутация - обнаружена в зо-

нах . - I, А, Ш, 1У, У, УП с неравномерным распределением. В зоне Ш - К>ра-Араксинской, явля«иейся самой информативной по количеству обследованных хромосом, частота J>°-2~1 составила - 23.5$, однако эта мутация не обнаружена в зонах У1 и X.

В Апшерснской и Гянджа-Казахской зонах, наблюдаются довольно высоки частоты этой нутации 46,и 31,2?, соответственно. Анализ родословных показал, что 6 из 7 мутаций в Апшеронском районе принадлежат азербайджанцам из Армении, в Гяндха-Казахской зоне 3 из 5 - азербайджанки, мигрировавшим из Грузии.

Третья мутация - J3>+-I-IIG (Г-А) иизет частоту встречаемости 12.775'. Ее наблюдали в зонах: П - 5С£, ' Ш - 10,%. 1У - 752, УП - Il.IIi. Эта мутация довольно часто встречается в странах орсдиземноморского бассейна в таких странах, как Греция, Иг ал «я, Кипр и Турция.

.Четвертая мутация - замена Т-С в 6 позиции ш$ого интроиа • ji-глоб адового гена у населения Азербайджана встречается с частот«! - 9,0$ и неравномерно распределена у населения республики." Выявлена в зонах - I (26,&), И (II,250 и УП (II.Il£). В ос-талыих зонах эта мутация отсутствовала.

По литературным данный известно, что все эти четыре мутации ^>-глобикового гена встречаются у населения 'Турции и отсутствуют у населения Исламской Ргспубликн Иран, имеюиеи общую границу о Азербайджанской Республикой.

Пятой по частоте встречаемости является мутация -Jb°E/9 (+Г), выявленная раннее у населения №дии с фана. Данная мутация надюна также у васелекия южных регионов республик: в Ленко-рань-А«срансхой зоне (У) а у Азербайджану в - выходов из Ген о-

ного Азербайджана (ИРИ). Частота этой гации для данного региона составила - 60,С^.

3 таблицз 4 представлены результаты этно-территориального распределения мутация р -глобинового гена у населения республики. Как видно из таблиц, все азербайджанцы были разделены на пять групп и различались только по регионам проживания. У азербайджанце из Грузки выявле ны.мутации: р°-2-1 и jE>*-I-TIO, тогда как у азербайджанца из Армении выявлена только одна мутация - jb°-2-l. У азербайджанцез из ЯРИ Есе ц хромосомы имеля Jb°fc/9 (+Г). Данная мутация также иденти тииирована у двух талы-сей, пропивающих на юго-воссже республики.

Штересные данные получены для малых этнических групп, проживающих в Азербаядггзне. Грузины-ингило?.цы, проживавшие на севере ре спубл кхи (Закаталы) , удины, проживающие в Кабалинском, аврцы из Кахскогэ района, относящиеся к '¿еки-Закатальской зоне (У1) имели мутацию - р°е (-АА). У лезгин Куба-ХачмасскоЯ зоны ( 1У) 75% мутаций также составила данная мутация. 10 обследованных хромосом от пяти гомозигот армянской национальности из нагорной части Карабаха имели эту же мутацию.

Наличие мутации кодона 8 (-АА) г высоких частотах - 35,1 Е£ у народностей, проживающих "в Азербайджане, свидетельствует о том, что эта мутация не ганесена в данный регион, а наоборот, путем миграции из этого региона попала в Малую Ази^ (нынешняя Ту-рция), а затем и в европейские популяции.

На рисунках I и 2 представлены геногеографическая карта мутаций jb-глобинового гена у населения Азербайджанской Взспуб-лики и сравнительная геногеографическая карта основных мутация Jb-глобиноЕОго гена s странах средиземноморского бассейна. Ближнего Зостока и Азербалджанскся Республики, соответственно.

Таким образом, геногеогра^ическке исследования мутаций, идентифицированных у населения Азербайджана, говорят об их неоднородна/ распространенности. Отмечается этко-территориальная связь отдельных мутаций. Составлена ген oreогра*иче екая карта мутацкя, идентифицированных у населения Азербайджана. включая административно-территориальные, зенальнуе к этно-территсриаль-ные-особенности их распределения, что поможет в созгании кои->«пции профилактики, вклп«агдей пренатальную диагностику тала iceu.i: в Аа?г'бйджане.

АгШЕПЕтративно-террЕторгальисе распределение оснозных иутацтП Ь-т ала сеет-! у населены

__Азербайджанской Рзсдублид. *_Таблица X 2-

Название _мутации ;ъ -г л о с и к о б о г . гена

региона ~8 ^-2-1 .ьМ-ПО Е>М-б Е>°У9 Остальн. Неиденти?. _Кол-во Част Кол-во част Кохич.Чзст Колич.Част Колич.Час-Кол.Част .Кол-во Част.

ГЬ окчай 2 18,1 I 9.05 2 18.1 8 45,4 - - - - I 9,С5

Удгар 2 20.0 - - - I 1С.0 2 20.0 - - ■ - - 5 5С.0

Агдаи 3 30.0 5 50.0 2 20.0 - - ______

Кврдаыир 7 58,3 2 16.6 I 6.3 2 16.5 ______

Агдап б 22.2 4 15.3 I 3.4 3 11,1 - " - - - 12 44.4

Джебраш! - I 25.0 - ___ - - - - 3 75,0

$изули I 25,0 2 50.0 - - I 25,0

Евлах - I 20,0 4 60.0 - - ______

Юекаха 4 75,5 - I 25,0 - - -

Хачмас - I 50.0 - - - - - - I 50.0

Аякроп - I 12.3 4 53.0 - - 3 37,5 _

Закатали 5 87,5 - _ ___ _ - _ _ I 1?,5

Не+тчала I 50.0 - - - ___ ____! 50,0

Кабала 8 ТСС, О - - _ ___ ______

Шеки ' 3 50,0 - - - ___ 3 50.0 -

бронзой - _ _ 0 100.0 - - ______

Сабирсба д, 2 40.0 2 4С.0 - _ _ _ _ _ _ _ I до,О

Эардоб." .3 50.0 3 50.0 - ___ ______

Камкир' V? 50.0 2 50.0 - ___ ______

Карабах /10 100,0 - - - ___ _______

Кгзип- - ' - - 2 100.0 - ___ ______

Агдхабедя г 1СС.С - __. ______

Сальяны I 25,0 - 2 75.0 - - - -

Исмаилды ? 50,0 I 25,С I 25,0 - - - -____

Куба 8 1СС.0 - - __ ______

Кахи 5 3 8,4 4 X, 8 4 30. 8 - ______

Ленкорань - - I 2С.С - 4 80,0 -

"О О Г 0-55-357П-4!> 22. У/ ' 24-12.77 IV У,С4-Ь 3,19 Ь ЗЛУ '¿Ь 13, КЗ-

Еональноз рзспрзггдетз основных ну та па ь -глобинозого гена у населения Азербайджана. ___£_§_Таблица 3 3

Еаэяансз зоны Ц утаи ад Л-глобмнсзого гена_

J!>02-I jb+1-IIC jb+I-б р°0/9 Остальа. Иеидьитиф.

Кол- Час- Кол- Час-Хол- Час- Кол- час- Код-Час- Кол- Чзс- Кол- Час-во тста го тога во тота во тота во тота во тота во тста

ЬАпгсронксая - - 7 Чб.б 4 ¿6,6 1 2Ь. б -

П. Гяндга-Казахсзад 3 10.7 5 31.2 О -'«9.9 - - - -- --

I.Kjrpa-Apascaiicsaa 27 25.2 25 23.3 II 10.3 12 II. 2 - - - 24 23.3

ХУ.КУСа-Хачкасехгл 3 75.С - - ' - - - - I 25,0

Т..Ленксраць-Астар;лас£Д I 20,0 - - - - 4 ST.С - - -

У1.2£ки-сзпагальскал 33 SC.C I А,5 - - , - _ ___ _ i

УП.Liîiaxa-Севанаiîd;кал б ^,7 1 ll.II I ИЛ I H.II -----УЕ.Кгдбадгар-ЕЗгбамнзсзал

И.Нахвчеьазсгая АР ---X. НКЛО 10 1СЮ.О ----- - - - -

ИТОГО 66 35.11 A3 22.87 24 12.8 17 f>,04 6 .3,2 6 3.2 25 13.83

Эти о-территориальное распределение нутаций ^»-глобинового геЕа у населения Азербайджана.

Название этни- Регион Количество ыутаций А-глобинавсго гена

ческой групп: проживания со ^>2-1 У-ПО -30 ^82/83 ^130 Не иде к. ти*.аллели

Азербайджану Азербайдаак 38 34 20 13 - 3 I 26

Азербайджану Груз кя ,1 3 1 _ - -

Азербайджану Армения - 6 - - -

Азе рбайдтанцы Иран - - и - -

Та ты-мусульмане Агпиерон - - 4 - -

Грузины ИНГ ил ой да Закаталы и, _ _ — — - — _ _

Аомяне из ИКАО Карабах 10 - _ _ - _

Карачаевка г. Баку - - - ' 2 - -

Лезгины Хачмас . 2 2 _ - -

Аварцы Кахи 3 ' I - - -

йлыши Ленкорань - - 2 - -

66 О 24 17 6 2 3 I 26

Рис. р . ГЪногесгрзтическая карта основных мутецпя ^-ГГ в странах Сгехиземнсыорсадго бассейна. Ближнего Востока и Азербайджанской Г^спублизе. Т. Португалия, 2. Испания, 3. ГГ «ратли.

ТС. Ирак, (Курдистан). II. Ливан, 1?. Азербайджан, 1Э.П-Рславия. 1«. Болгария.

Для описания котнпвческюг проявления (геиатологйческн а бвохпгачесхсз показателя крозн) ыутаца ^?>-глобинового гена а а оочетанпл обследозано 75 Солышх (30 гоиозягот я вошауя-доз). Зсзраст больн>.'* варьировал ст 9 иесяцзв до 20 ¿эт. Для аглдсго больного описана гвьптологкческсз д бкохстооигэ псха-пагвлз вроза, представленные э таблаф 5.

Некболев тягглое течение болязна среди гоиозггот вабл^да-егол пря гснотппе - *-Т-1Ю/£>М-П0. Этиц болыши требуется еяэ^сячнм ггрелкзаняо хрози. Болезнь сопровождается гносапп звачзиг.ил дуального геиоглэбина

К т.тмлоя трэнс^узпя-заэяскуся ^орьэ так.-э относится дгз гр7пп г01,*азагот о иутац:гшя: ^°82/33 я пзрзал гз

которах описывается згзрЕые.

3 средня групгя тягести - гоиозиготн о гэпогяпоы - ¿Ре/^Рй, Срэдз. обслздоганвых васлвдала выссзгэ значения 1ЙГ (93-100? э орздсзи нззкга значения ^вррвтип (220 кг/цл), свгдзтзлъ-

стзуе? о дэпйЧЕтельнсч пиолкэе эритроцит оз. Этт больтш про-¡ззодсля перзлсгаисз зрозп 3-5 раз в год.

Лля ?рэг гзнотдвоз о гз1аэсгс?й0сгм цггацпя: -2-1,^1-6 яр* -23-харзкторзо стзртез точено болззпз н раэогл оизгсд-п^з гзрэлкгаапл а роз и. К даннся группа отнооасл ззросяил коа-гпгзз? Сольных (э орздизц 20 ¿зт). Слздогало бы опзтпть, что дгз гоисзпготи э зсзрзстз 25 я 24 года о мно?ягпиз:^>+Т-б/^ь+1-б а £ + -ГО родяла дпух дзэст - гзтерозиго?.

Срзда сзсга групп зоупуадоэ обваругзгу дгз группу болыш со срдгзя а стертоп кашизсл богззпа. 1С орзд!гзя групп? ?пзэстя бе.-23йя стаосгтся лс^ о ссявтагапия иута^Д: »

а £+-1-П0, получаслгз 3-5 гзрзлпзапсл з год.

Стэртуо 2ля=зу гузля аснгаунды:^СфМ-б а^-2-1/^+1-6, болъа'Э пз солучалз сзрздггзпвл крози (орэдкаа зезрае? 10,5 сэ?). Из (--асвол^доэокая таела стиооггелько аор'злыгыэ эп--чгзя гзгагологстесаах позазата^зл зрозв.

Лая гае по составу г^иоглсбага з плггсмсгпоса гсзаздтз-7 100 ззрсздз с аосстельстзсл 5-?ахзссеип

Скрининг гетерозиготного носительства: показания, эффективность

В отличие от скрининга на генетические заболевания у новорожденных или генетическую предрасположенность у пациентов, скрининг на носительство менделирующих болезней имеет как основную цель идентификацию здоровых индивидуумов, имеющих высокий риск (25%) рождения детей с тяжелой аутосомно-рецессивной или Х-сцепленной патологией. Принципы скрининга гетерозиготного носительства показаны в блоке.

Для того чтобы обеспечить достаточное выявление носителей, имеющиеся программы скрининга гетерозигот фокусируются на конкретных этнических группах с высокой частотой мутантных аллелей. Скрининг гетерозиготного носительства добровольный и направлен на людей, идентифицирующих самих себя как участников конкретной этнической группы высокого риска.

Скрининг гетерозиготного носительства широко используют для ряда заболеваний со сравнительно высокой частотой носительства: болезни Тея-Сакса — прототип такого скрининга, болезней Гоше и Канавана в популяции евреев ашкенази; серповидноклеточной анемии в популяции афроамериканцев Северной Америки; b-талассемии в областях с высокой встречаемостью, особенно на Кипре и Сардинии или в крупных кровнородственных семьях из Пакистана.

Технология одновременного обнаружения множества различных мутантных аллелей в гене в ходе единственной процедуры (мультиплексное исследование) делает возможным выполнять популяционный скрининг гетерозигот по муковисцидозу, изучая непосредственно ген CFTR на наличие мутаций. Наибольшая сложность при скрининге носительства мутаций в гене CFTR прямым обнаружением мутантных аллелей — выраженная аллельная гетерогенность во многих популяциях и различия в составе аллелей в разных этнических группах.

Например, тестирование с применением базовой панели на 23 мутации (F508 и 22 наиболее частые мутации, обнаруженные у европеоидов неиспанского происхождения), предлагаемое Американским институтом медицинской генетики, может идентифицировать почти 88% всех мутаций и, следовательно, около 80% пар с риском муковисцидоза (т.е. тех, где оба партнера гетерозиготны по мутациям гена CFTR) указанного этнического происхождения. Внесение в панель дополнительных аллелей только незначительно увеличивает чувствительность теста у европеоидов неиспанского происхождения.

Критерии программ скрининга гетерозиготного носительства:
• Высокая частота носителей, по крайней мере, в конкретной популяции.
• Доступность недорогого и достоверного теста с очень низким числом ложноотрицательных и ложноположительных результатов.
• Доступ к генетическому консультированию для пар, идентифицированных как гетерозиготные носители.
• Доступность пренатальной диагностики.
• Приемлемость в обществе и добровольное участие популяции, подлежащей скринингу.

В других популяциях, например испанцев, азиатов и афроамериканцев, частоты и распределение мутантных аллелей совершенно другие. Базовая панель из 23 аллелей обнаружит только 72% носителей среди испанцев, 64% носителей среди афроамериканцев и 49% носителей среди американцев азиатского происхождения. Для таких популяций необходимы расширенные, этнически специфичные панели. Таким образом, многие диагностические лаборатории используют панель мутаций, определяющую мутации F508 плюс четыре десятка других аллелей. В отличие от этого, в популяции евреев ашкенази тестирование только на пять мутаций обнаруживает 94% носителей, что показывает более высокую чувствительность при определении меньшего числа мутаций.

Влияние скрининга носительства при более низкой встречаемости генетического заболевания может оказаться весьма выраженным. Скрининг носительства при болезни Тея-Сакса в популяции евреев ашкенази проводят с 1969 г. Скрининг сопровождался пренатальной диагностикой, уже снизившей встречаемость болезни Тея-Сакса в этой этнической группе на 65-85%.

Предотвращение b-талассемии за счет обнаружения носительства и пренатальной диагностики привело к аналогичному снижению встречаемости болезни на Кипре и Сардинии. В отличие от этого, попытки выявить носителей серповидноклеточной анемии в США в сообществе афроамериканцев оказались менее эффективными и повлияли в меньшей степени на встречаемость болезни.

Успех скрининга носительства при болезни Тея-Сакса и b-талассемии, а также относительная неудача при серповидноклеточной анемии подчеркивают значение общественного согласия на исследования, уровня образования и доступность генетического консультирования и пренатальной диагностики как критически важных требований для эффективности программы.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Как разрабатываются диагностические панели Genetico

Одним из важных направлений работы лаборатории Genetico является разработка скрининговых генетических тестов и проведение генетических анализов на их основе. При создании любых скрининговых тестов одним из главных аспектов является технология, на основе которой разрабатывается тест. Эта статья расскажет Вам, какую технологию использует наша лаборатория и как мы подходим к разработке своих тестов, почему получаемые результаты полностью достоверны, а сочетание цены и качества такого теста самое приемлемое.

Во-первых, следует разобраться, что такое скрининговые анализы. Это такие анализы, которые позволяют быстро и сравнительно легко, за счет использования одной методики, получить результаты по нескольким интересующим параметрам за раз. В случае генетического скрининга параметры – это наличие/отсутствие определенных мутаций. Набор мутаций (панель), которые идентифицируется по результатам теста, — это основа информативности скрининга. Дело в том, что мутации необходимо выбирать по двум основным признакам:

— клиническая значимость, то есть действительно ли наличие мутации вызывает какие-то нарушения работы организма и/или заболевания,

— частота мутации в популяции, для которой готовится панель.

Если какая-то мутация встречается редко, но вызывает серьезное заболевание, и даже носительство этой мутации может быть потенциально опасно, то это веская причина включить ее в набор анализируемых мутаций. С другой стороны, некоторые мутации и связанные с ними заболевания встречаются настолько редко в определенной группе людей, что включать их в скрининговый анализ неэффективно – вероятность, что попадется хотя бы один носитель, очень мала, в то время как ее можно заменить более частой, а потому более информативной мутацией. Таким образом, первым этапом создания эффективной в условиях российской популяции скрининговой панели является работа с опубликованными научными данными для поиска мутаций, связанных с заболеваниями и относительно часто встречающихся в российской популяции. Итак, в случае панелей лаборатории Genetico параметром, который определяется скрининговым анализом, является наличие/отсутствие мутаций в разных генах, а общая методика – это анализ продуктов Полимеразно-Цепной Реакции (ПЦР).

На третьем этапе нужно понять, как идентифицировать саму мутацию. То есть, как различить полученные в результате ПЦР кусочки ДНК, ведь мутации иногда бывают в изменении всего лишь одного нуклеотида. Для этого используют специальные зонды – они взаимодействуют с ДНК и светятся определенным цветом. Одновременно в пробирке находятся: наработанные в ПЦР кусочки, которые мы должны отнести к мутантным или немутантным, и два зонда. Один из них может соединиться только с нормальной ДНК и если соединяется, то дает зеленый свет (в прямом смысле слова будет светиться зеленым, но только чувствительный прибор сможет «увидеть» это свечение). Другой зонд может соединиться только с мутантной молекулой ДНК и при соединении с ней давать красный свет. Получается, что если в пробирке только нормальные кусочки ДНК, то свет от нее будет только зеленый, а если только мутантные — только красный. Если же изначально образец был взят у гетерозиготы по этой мутации, то пробирка будет светиться примерно 50:50 в зеленом и красном спектре. Подбор этих зондов и является третьим и очень ответственным этапом разработки теста. На этом этапе также важно убедиться, что подобранные зонды позволяют однозначно различить мутантные и нормальные молекулы ДНК – для этого проводятся проверка их работы в «полевых» условиях, то есть в пробирке на образцах ДНК.

Теперь разберемся, зачем вообще нужно увеличивать количество ДНК с помощью ПЦР. Ведь мы можем добавить зонды сразу в образец ДНК, они соединятся/не соединятся и будут светиться определенным цветом. Дело в том, что приборы, выявляющие степень свечения, имеют ограничения по тому, насколько малый уровень сигнала они могут уловить. И оказывается, что ДНК, выделенной из образца 5 мл крови, недостаточно, чтобы сигнал от конкретного участка был достаточно сильным. Плюс к этому, мы нарабатываем именно нужный для анализа участок ДНК, поэтому убирается ошибочный сигнал из-за случайного взаимодействия зондов с неинформативными для анализа участками ДНК.

Таким образом, общая схема анализа с помощью скрининговой панели такова: забор биологического материала – выделение ДНК из этого образца – постановка ПЦР для увеличения количества нужного участка ДНК – идентификация мутации с помощью светящихся зондов. Однако в случае панелей конкретика очень важна. А именно, что позволяет проводить анализ сразу на несколько мутаций и использовать для этого минимальное количество образца.

В лаборатории Genetico для проведения анализа по панелям мы используем технологию Fluidigm. Она основана на проведении ПЦР в очень маленьких объемах (меньше 0,2 микролитров). Это позволяет, с одной стороны, использовать минимальное количество ДНК и, с другой стороны, одновременно проводить анализ 48 мутаций для 45 образцов. То есть за один раз можно узнать информацию по 48*45=2160 точкам. Эта технология удивительна по своей простоте и эффективности. Каждый маркер (смесь затравок-праймеров и зондов, нужных для идентификации одной мутации)мы наносим вручную только один раз в специальную лунку, так же как и каждый образец – в другую лунку. А вот получение отдельной смеси образца с каждым из маркеров происходит с помощью микроканалов в маленьких-маленьких лунках (они обозначены на картинке). В каждой микролунке происходит отдельная ПЦР, продукты которой светятся зеленым или красным. Мы знаем в какой лунке какой образец с каким маркером смешан, поэтому можем сделать вывод о генотипе каждого образца по каждому маркеру.

Важным аспектом в любом количественном измерении является контроль. Вдруг забыли что-то добавить, или какой-то реагент испортился, или ДНК в образце было недостаточно. Для этого мы в каждом анализе используем ряд положительных и отрицательных контролей. Отрицательный контроль (в нем отсутствует ДНК, поэтому правильно, когда в таких точках нет никакого свечения, так как зондам не с чем связываться) задает фоновый уровень свечения, который берется в измерении за относительный ноль. Такой контроль необходим для отслеживания чистоты помещений и растворов от случайной ДНК, чтобы исключить возможность ложноположительных результатов. Положительных контролей всегда три. Их мы готовим специальным образом: для каждой мутации искусственно синтезируется отдельно молекула ДНК без мутации и с ней. Для положительного контроля нормальной гомозиготы по всем мутациями смешиваются все 48 синтезированных молекул с нормальными последовательностями. Тогда получается искусственно созданный образец, который по всем исследуемым мутациями будет заведомо нормальной гомозиготой. Для контроля мутантных гомозигот формируется подобная смесь из мутантных молекул ДНК по всем анализируемым мутациям. Для гетерозиготного контроля смешивается в соотношении 1:1 молекулы с мутациями и без мутаций по каждой мутации. Такие синтетические положительные контроли получить сложнее, чем просто взять образец ДНК человека, который оказался, например, нормальной гомозиготой, но они дают более точное контрольное значение. Значение исследуемого маркера в образце сравнивают со значением каждого из трех контролей и, соответственно, относят к гетерозиготе или одной из гомозигот.

После полной разработки панели и положительных контролей для нее, необходимо проверить ее точность и эффективность. Для этого проводят анализ сотни-двух образцов с помощью разработанного скринингового анализа и с помощью другого менее удобного и часто дорогостоящего метода. Результаты, полученные обоими методами, должны совпасть по всем образцам. Так же на этом этапе мы можем определить, насколько включенные в панель мутации информативны в условиях России. Дело в том, что научные данные о частоте разных мутаций в российской популяции в большинстве случаев отсутствуют, поэтому на первом этапе разработки теста мы руководствуемся данными по европейской популяции. Потом мы делаем предварительную оценку по частоте мутаций именно в России, по тем данным, которые получили в ходе работ по разработке панели. Как упоминалось выше, это важно для повышения ее эффективности – если какая-то мутация встречается крайне редко, то лучше ее заменить на другую, более частую, так как размер панели ограничен. Однако наша работа по разработке генетического теста не заканчивается на его выпуске для клинического использования. Научная информация в нашей лаборатории и во всем мире каждый день пополняется, поэтому мы постоянно мониторим полученные по нашим клиническим данным частоты мутаций, дорабатывая таким образом эффективность панелей; следим за появлением в научных статьях данных о новых клинически значимых мутациях и можем добавлять их в наш анализ. Кстати, сданный Вами генетический тест приносит пользу не только Вам, но и пополняет немногочисленную, к сожалению, на сегодняшний день информацию о россиянах, помогает развивать фундаментальную и прикладную популяционную генетику и медицину. Конечно, только в том случае, если Вы подписали документ о том, что согласны с использованием ваших данных в исследовательских целях.

Таким образом достигается высокая точность, информативность и эффективность всех разрабатываемых лабораторией Genetico скрининговых диагностических тестов. Интересно отметить, что высокопроизводительную технологию Fluidigm и систему из синтетических контролей для генетического анализа в России использует только наша компания. О том, кому необходимо сдавать такие анализы и о чем расскажут результаты, вы можете посмотреть на странице соответствующей услуги на нашем сайте.

*для лучшего понимания текста можно ознакомиться с основными генетическими терминами.

Рекомендации по применению фармакогенетического тестирования в клинической практике

Клиническая фармакогенетика — это раздел клинической фармакологии и клинической генетики, изучающий место и роль генетических факторов в формировании ответа организма человека на лекарственные средства (ЛС): эффективность, не эффективность, развитие неблагоприятных побочных реакций (НЛР). Закономерности, выявляемые фармакогенетикой, позволяют врачу индивидуально подходить к выбору как самих ЛС, так и их доз у каждого конкретного пациента, обеспечивая максимально эффективную и безопасную фармакотерапию. Генетические особенности пациентов, ассоциированные с изменениями фармакологического ответа, выявляются при проведении фармакогенетического тестирования. Фармакогенетический тест — это выявление конкретных генотипов, ассоциированных с изменением фармакологического ответа. В основе таких тестов лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). При этом в качестве источника ДНК для ПЦР (т. е. генетического материала) используются чаще всего кровь больного или соскоб буккального эпителия. Сбор этого биологического материала у больного не требует предварительной подготовки. Результаты фармакогенетического теста представляют собой идентифицированные генотипы больного по тому или иному полиморфному маркеру. Как правило, врач-клинический фармаколог интерпретирует результаты фармакогенетического теста — формулирует рекомендации по выбору ЛС и его режима дозирования для конкретного пациента. Применение таких тестов позволяет заранее прогнозировать фармакологический ответ на ЛС и персонализировано подойти к выбору ЛС и его режима дозирования, а иногда и тактику ведения пациентов. В будущем ожидается увеличение количества фармакогенетических тестов, которые целесообразно использовать в клинической практике для персонализации выбора ЛС и их доз, также как и повышение доступности фармакогенетического тестирования для российских врачей и пациентов.

Ключевые слова

Раскрытие информации о конфликте интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Информация о статье:

Депонировано (дата): 05.06.2018

Автор прочитал и одобрил окончательный вариант рукописи.

Информация о рецензировании:

"Качественная Клиническая Практика" благодарит анонимного рецензента (рецензентов) за их вклад в рецензирование этой работы.

Комментарий редакции:

В случае возникновения разночтений в тексте или расхождений в форматировании между pdf-версией статьи и её html-версией приоритет отдаётся pdf-версии.

Для цитирования:

Сычёв Д.А. Рекомендации по применению фармакогенетического тестирования в клинической практике. Качественная Клиническая Практика. 2011;(1):3-10.

Введение

Клиническая фармакогенетика – это раздел клинической фармакологии и клинической генетики, изучающий место и роль генетических факторов в формировании ответа организма человека на лекарственные средства (ЛС): эффективность, не эффективность, развитие неблагоприятных побочных реакций (НЛР) [1]. Закономерности, выявляемые фармакогенетикой, позволяют врачу индивидуально подходить к выбору как самих ЛС, так и их доз у каждого конкретного пациента, обеспечивая максимально эффективную и безопасную фармакотерапию [2].

Предметом изучения клинической фармакогенетики выступают особенности генетического аппарата, которые ассоциированы с изменениями фармакологического ответа (генетически детерминированный фармакологический ответ) у пациента. Клиническая фармакогенетика является смежной дисциплиной на стыке клинической фармакологии и клинической генетики [3, 4]. Хотя роль наследственности в формировании индивидуального ответа на ЛС известна давно, понимание механизмов, связывающих генетические особенности пациента с изменением эффективности и безопасности фармакотерапии, стало возможным лишь к настоящему времени, в связи с развитием соответствующих методов молекулярной биологии и реализацией международной программы «Геном человека» [5].

Эти генетические факторы (а по сути, генетические особенности пациента), как правило, представляют собой полиморфные участки генов, продукты которых, так или иначе, участвуют в осуществлении различных фармакокинетических и фармакодинамических процессов [4, 6].

К первой группе относятся гены, кодирующие ферменты биотрансформации и транспортеры, которые осуществляют всасывание, распределение и выведение ЛС из организма. В настоящее время, активно изучается роль генов, контролирующих синтез и работу ферментов биотрансформации лекарственных средств, в частности изоферментов цитохрома Р-450 (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 и т.д.), ферментов II фазы биотрансформации (N-ацетилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы) и транспортеров ЛС (Р-гликопротеин, транспортеры органических анионов и катионов) [4].

Во вторую группу входят гены, кодирующие «молекулы-мишени» ЛС или функционально связанные с данными структурами белки (рецепторы, ферменты, ионные каналы). Также сюда включены гены, продукты которых участвуют в различных патологических процессах (факторы свертывания крови, аполипопротеины, гены системы HLA и т.д.), «против» которых направлена соответствующая фармакотерапия [4].

Выше описанные генетические особенности пациентов, ассоциированные с изменениями фармакологического ответа, выявляются при проведении фармакогенетического тестирования [2].

Фармакогенетический тест – это выявление конкретных генотипов, ассоциированных с изменением фармакологического ответа. В основе таких тестов лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). При этом в качестве источника ДНК для ПЦР (т.е. генетического материала) используются чаще всего кровь больного или соскоб буккального эпителия [2]. Сбор этого биологического материала у больного не требует предварительной подготовки. Результаты фармакогенетического теста представляют собой идентифицированные генотипы больного по тому или иному полиморфному маркеру. Как правило, врач-клинический фармаколог интерпретирует результаты фармакогенетического теста – формулирует рекомендации по выбору ЛС и его режима дозирования для конкретного пациента. Применение таких тестов позволяет заранее прогнозировать фармакологический ответ на ЛС и персонализировано подойти к выбору ЛС и его режима дозирования, а иногда и тактику ведения пациентов. Предполагается, что внедрение новых технологий тестирования, основанных на «микрочипах» (microarray-technology, ДНК-чипы), позволит определять не отдельные полиморфизмы конкретных генов, а проводить тотальный скрининг сразу всех (или почти всех) аллельных вариантов в геноме человека, ассоциированных с изменением фармакологического ответа на то или иное ЛС, что, собственно, и является задачей фармакогеномики. При этом, в будущем, станет возможным составление т.н. генетического паспорта пациента. С этих позиций фармакогеномика, рассматриваются как перспективные направления персонализированной медицины будущего [7].

Условия для проведения фармакогенетического тестирования в клинической практике

Отбор пациентов для проведения фармакогенетического тестирования. Фармакогенетическое тестирование особенно показано [2, 4]:

Пациентам с высоким риском развития НЛР;
Пациентам с наследственным анамнезом по НЛР.

Требования к ЛС для персонализации, применения которого планируется использование фармакогенетического теста [2, 4]:

ЛС не имеет альтернатив в той или иной клинической ситуации:
ЛС с большим спектром и выраженностью нежелательных лекарственных реакций (НЛР);
ЛС должно применяться длительно / пожизненно;
ЛС имеет узкий терапевтический диапазон
ЛС эффективно у ограниченного числа пациентов, что особенно актуально для дорогостоящих ЛС.

Требования к фармакогенетическому тесту для использования в клинической практике [2, 4]:

наличие выраженной ассоциации выявляемого аллельного варианта того или иного гена с изменением фармакологического ответа (развитием НЛР, недостаточной эффективностью или высокой эффективностью);
фармакогенетический тест должен с высокой чувствительностью и специфичностью прогнозировать фармакологический ответ (развитие НЛР, недостаточная эффективность или высокая эффективность);
должен быть разработан алгоритм применения ЛС, в зависимости от результатов фармакогенетического тестирования (выбор ЛС, его режима дозирования);
выявляемый аллельный вариант должен встречаться в популяции с частотой не менее 1%;
должны быть доказаны преимущества (в т.ч. и экономические) применения ЛС с использованием результатов фармакогенетического теста, по сравнению с традиционным подходом (повышение эффективности, безопасности фармакотерапии и экономическая рентабельность подобного подхода);
фармакогенетический тест должен быть доступен для врачей и пациентов.

В настоящее время, этим требованиям частично или полностью удовлетворяет ограниченное число фармакогенетических тестов. Ниже приводятся рекомендации по применению в клинической практике фармакогенетических тестов:

применение которых регламентировано инструкциями по медицинскому применению ЛС, одобренными FDA, EMA, Министерством здравоохранения и социального развития РФ [8];
применение которых рекомендуется экспертами Европейского научного фонда и одобрено участниками Конференции по фармакогенетике и фармакогеномике в Барселоне в июне 2010 года (опубликованы в марте 2011 года) [9].

Варфарин

Показания для применения фармакогенетического теста:

Выбор начальной дозы варфарина у пациентов с тромбозами (ТЭЛА, тромбозы глубоких вен и другие венозные тромбозы, артериальные тромбоэмболии, включая эмболический инсульт) и у пациентов с высоким риском тромботических осложнений (постоянная форма фибрилляции предсердий, протезированные клапаны, послеоперационный период, в т.ч. в ортопедической практике).

Аллельные варианты (полиморфизмы), которые необходимо определять.

CYP2C9*2 (rs1799853) и CYP2C9*3 (rs1057910)- аллельные варианты (полиморфные маркеры) гена CYP2C9 (кодирует основной фермент биотрансформации варфарина).
Полиморфный маркер G3673A (rs9923321) гена VKORC1 (кодирует молекулу-мишень для варфарина- субъединицу 1 витамин К экпоксидредуктазного комплекса).

Частота выявляемых аллельных вариантов (полиморфизмов) в российской популяции. Частота генотипов по CYP2C9, соответствующих медленным метаболизаторам (носительство аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3), в российской популяции составляет от 20-35%, что сопоставимо с европейскими этническими группами [10]. Частота генотипа АА по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 в российской популяции составляет 13%, что сопоставимо с европейскими этническими группами [11].

Ассоциации между выявляемыми аллельными вариантами (полиморфизмами) генов с изменениями фармакологического ответа. Однозначно доказано, в т.ч. и в отечественных исследованиях, что носительство аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 и генотип АА по полиморфному маркеру G1639A ассоциируются с низкими подобранными дозами варфарина, нестабильность антикоагулянтного эффекта, более частыми кровотечениями при его применении 16. Фармакогенетическое тестирование заключается в определении у пациента генотипов по CYP2C9 и VKORC1.

Медико-генетическая консультация

В профилактике наследственных заболеваний значение медико-генетического консультирования переоценить невозможно. Задача специалистов, работающих в данном направлении – определить вероятность рождения ребенка с наследственными патологиями и постараться объяснить семейным парам возможность развития того или иного события. Кроме этого, здесь же, в стенах медико-генетической консультации, семье помогут принять решение о дальнейшем деторождении. Медико-генетическое консультирование как способ профилактики врожденной или наследственной патологии особенно эффективно до зачатия или на самых ранних сроках беременности.

Медико-генетическая консультация:

- консультация генетика: (беременные группа риска, пренатальный консилиум, ВКК);
- Планирование беременности, подготовка к ЭКО и ВМИ;
- Консультация семейных пар с бесплодием и с ОАА;
- Дети с НЗ;
- Носители ХА;е исследование Цитогенетическое исследование

Цитогенетическое исследование:

Кариотипирование;
ДНК-фрагментация;
НВА-тест;
Биоптат ворсин хориона (замершие беременности);
с.Ди-Джорджи;
FISH спермы;

Пренатальная инвазивная диагностика:

Биопсия хориона;
Плацентоцентез;
Амноицентез;
Кордоцентез;

Пренатальный скрининг беременных женщин:

б/х скрининг (РАРР_А/ВХГЧ);
Преэклампсия –PLGF;

Неонатальный скрининг:

Фенилкетонурия- ФКУ
Врожденный гипотиреоз-ВГ

Медико-генетическое консультирование включает в себя 3 этапа:

Уточнение диагноза с использованием специальных генетических методов: генеалогическое обследование и составление родословной; биохимико-генетические методы, позволяющие выявить генетически обусловленные изменения обмена веществ; диагностика гетерозиготного носительства рецессивных аллелей; пренатальная диагностика (УЗИ, биохимический скрининг маркерных белков в сыворотке беременной, плацентоцентез).
Определение прогноза потомства, который основывается на данных о типе и варианте наследования патологического состояния, результата пренатальной диагностики.
Формулирование заключения и объяснение заинтересованным лицам в доступной форме смысла генетического риска.

Через медико-генетическое консультирование рекомендуется пройти всем семьям, планирующим иметь ребенка. Но специалисты выделяют показания для обязательного направления к специалисту-генетику:

установленная или подозреваемая наследственная болезнь в семье;
кровнородственные браки;
воздействие возможных мутагенов или тератогенов до, или в течение первых трёх месяцев беременности;
значимые отклонения результатов биохимического скрининга маркерных сывороточных белков у беременной;
выявление у плода маркеров хромосомных болезней и врожденных пороков развития при ультразвуковом исследовании.

Оборудование отделения «Медико-генетическая консультация»

До 2014 года биохимический скрининг проводился на мультифункциональном анализаторе VICTOR 2 с программой для расчета рисков хромосомной патологии у плода LifeCycle 2.2.

С января 2014 года ГЦРЧ начал проводить 1 биохимический скрининг на сухих пятнах на автоматизированном анализаторе AutoDELFIA LifeCycle 4.3.

Характеристика универсального автоматического иммунофлюоресцентного планшетного анализатора АвтоДельфия:

Читайте также: