Цитохимия и биохимия аномалий клеток крови

Обновлено: 27.03.2024

Клиническая лаборатория была организована в 1933 году: уже три четверти века специалисты лабораторных подразделений 1 РКБ обеспечивают лечащих врачей объективной и надежной информацией, необходимой для правильной постановки диагноза и оценки эффективности лечения.

Лаборатория сегодня:

  • более 50 квалифицированных специалистов, в т.ч. 3 кандидата медицинских наук, 11 врачей высшей квалификационной категории;
  • более 120 единиц сложного лабораторного оборудования,
  • в т.ч. производства Японии, Германии, США, Франции, Голландии;
  • использование современных информационных технологий, компьютеризация рабочих мест, электронная база данных результатов исследований;
  • более 10 лет участия в Федеральной системе контроля качества ФСВОК и четыре года - в международной системе качества EQAS;
  • более 300 наименований исследований и более 5 тысяч лабораторных исследований ежедневно - почти 2 миллиона анализов в течение года.

Пациентам нашей больницы доступны следующие виды лабораторных исследований:

специализированные исследования клеточного состава крови и костного мозга с использованием методов классической цитохимии, иммунофенотипирования методом проточной цитофлуориметрии; диагностика нарушений хромосомного аппарата при опухолевых заболеваниях системы крови методами ПЦР, цитогенетики и Р18Н-диагностики;

химико-микроскопические исследования биологических материалов (моча, мокрота, спинномозговая жидкость и др.) с использованием методов световой и люминесцентной микроскопии; цитологическая диагностика онкологических заболеваний (онкоцитология);

полный спектр биохимических исследований крови: электролиты, ферменты, азотистый обмен, липидный обмен, электрофорез белков, обмен углеводов с определением гликозилированного гемоглобина методом ВЭЖХ, выявление нарушений порфиринового обмена, кислотно-щелочное состояние;

коагулогические исследования для оценки состояния системы свертывания крови: стандартная гемограмма, диагностика дефицита факторов свертывания при гемофилиях, нарушений тромбоцитарного звена гемостаза, тромботических состояний и ДВС-синдрома;

комплекс иммунологических исследований: развернутая иммунограмма (с возможностью получения консультации врача-иммунолога после получения результатов исследования), определение групповой и резус-принадлежности крови с обнаружением иммунных антител к клеткам крови;

иммуноферментный анализ: гормоны щитовидной железы, гипофиза, надпочечников и половых желез, онкомаркеры, витамины, диагностика нарушений обмена железа, аутоиммунных заболеваний, аллергодиагностика;

диагностика неотложных состояний, выполнение жизненно важных исследований в круглосуточном режиме.

Гематологическая лаборатория

Гематологическая лаборатория БУЗ УР «1 РКБ МЗ УР» создана в октябре 2008 года с целью развития высокотехнологичных методов исследования системы крови, трансплантации стволовых кроветворных клеток. В состав лаборатории входят: кабинет для морфологического и цитогенетического исследования, кабинет для проточной цитофлюориметрии и ПЦР-лаборатория. Оборудование: 6-цветный лазерный проточный цитофлюориметр FACSCanTo II, прибор для количественной ПЦР в реальном времени IQ-5 (BIORAD), бинокулярные микроскопы с системой визуализации изображения, вспомогательное оборудование.

Сотрудники лаборатории:

  1. Бесогонова Татьяна Владимировна - врач высшей квалификационной категории
  2. Щуклина Наталья Сергеевна - врач высшей квалификационной категории, Заслуженный работник здравоохранения УР
  3. Александрова Ольга Валентиновна - биолог клинической лабораторной диагностики, высшей квалификационной категории
  4. Широбокова С.В . - фельдшер-лаборант

Перечень услуг:

Основные направления деятельности гематологической лаборатории:

Морфологическое и цитохимическое исследование клеток костного мозга и периферической крови у пациентов с гематологическими заболеваниями, в том числе опухолями системы крови - лейкозами.

Проточная цитофлюориметрия для определения показателей клеточного звена иммунитета, фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов крови, выявления опухолевых клеток по наличию специфических антигенов и рецепторов на их поверхности, подсчета стволовых кроветворных клеток.

Стандартное цитогенетическое исследование, позволяющее выявить хромосомные нарушения, ведущие к развитию онкогематологических заболеваний, для определения прогноза заболевания, тактики и мониторинг терапии.

ПЦР - определение патологических генов при опухолях системы крови.

Уникальные технологии:

Гематологическая лаборатория ГУЗ «1 РКБ» единственная в Удмуртии проводит стандартное цитогенетическое исследование при опухолях системы крови, проточную цитофлюориметрию при гематологических заболеваниях, определение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов крови методом проточной цитофлюориметрии, ПЦР - определение патологических генов при опухолях системы крови, подсчет и определение жизнеспособности стволовых кроветворных клеток.

ПЕРЕЧЕНЬ ВЫПОЛНЯЕМЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Гематологические исследования

Наименование исследований

Общий анализ крови (на гематологических анализаторах)
лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, гематокрит, тромбоциты, MCV, VCH, МСНС

Общий анализ крови (на гематологическом анализаторе PENTRA 120 RETIC) дополнительно - полная лейкоцитарная формула с детекцией патологических клеток; под­счет ретикулоцитов с определением степени их зрелости по содержанию РНК

Лейкоцитарная формула (микроскопия)

СОЭ (по Панченкову)

Время свертывания и кровотечения

Сахар (глюкоза) крови из пальца — в поликлинике и лаб.реанимации

Сахарная кривая (тест толерантности к глюкозе) - в поликл. и лаб.реанимации

Цитохимия и биохимия аномалий клеток крови

Цитохимия и биохимия аномалий клеток крови

Лейкоцитарные и тромбоцитарные аномалии делятся с цитохимической и энзиматической точек зрения на следующие группы:
а) аномалии без изменений или с менее заметными изменениями цитохимических реакций и энзиматической активности и
б) аномалии, при которых цитохимические или/и цитоэнзиматические изменения являются основным элементом клеточной аномалии и отражают биохимические изменения всего организма.

аномалия Мея-Хегглина

К первой группе принадлежит ряд аномалий, при которых отмечаются следующие изменения:
1) При аномалии Мей-Гегглина констатируется рост ряда лейкоцитарных энзимов: энолазы, пируваткиназы, LDH. В тромбоцитах установлен количественный рост некоторых гликолитических ферментов (Bessis).
2) При аномалии гиперсегментирования ядер нейтрофилов, реакция пероксидаз оказалась повышенной в нейтрофилах (Bessis).
3) По поводу аномалии Пельгера-Гюета, мы предприняли вместе с Micu и другими сотрудниками ряд цитохимических и энзиматических исследований, а также и по молекулярной биохимии. Среди выполненных тестов, кариотип, хроматограмма и спектрограмма РНК дали нормальные результаты; цитохимические реакции и энзиматическая деятельность были вообще нормальными, только реакция FAL была значительно понижена в нейтрофилах "Pelger", а в одном случае, совершенно отрицательная.

Мы не сумели объяснить механизм этого понижения и отсутствия деятельности FAL; следует однако отметить, что у никого из исследованных и находившихся долгое время под надзором больных не появились признаки хронического миелолейкоза (Gingold и сотр.)

Аномалия Джорданса - вакуолизация нейтрофила

Во вторую группу корпускулярных аномалий, при которых цитохимические или/и энзиматические изменения представляют основное проявление, входят следующие:
а) Аномалия Джорданса; вакуоли в лейкоцитах и моноцитах содержат липидовый материал.
б) При аномалии Алиуса-Григнаски основной модификацией является генетическое отсутствие реакции пероксидаз в нейтрофилах, а также и реакции жиров, без других общих биохимических изменений.
в) При аномалии Презентеи, отсутствие реакции пероксидаз в эозинофилах не сопровождается другими общими биохимическими изменениями.
г) При аномалии вакуолизации лимфоцитов, сопровождающей синдром семейной амавротической идиотии, вакуоли в лимфоцитах содержат гликолипидовое вещество, лишь частично идентифицированное, а синдром семейной амавротической идиотии считается энзимопатией, ведущей к скоплению различных жировых веществ. Следовательно, цитохимическое изменение лимфоцитов отражает энзимопатию и общий дизлипидоз (Bessis).
д) Аномалия Альдера, характеризующаяся обязательной ассоциацией с одной из форм синдрома Пфаундлера-Гурлера, представляет собой частичное явление общего процесса мукополисахаридоза. В гранулоцитах, Astaldi и Mauri нашли кислотные полисахариды и гликоген.
е) Аномалия Чедиака-Штейнбринка представляет следующие характерные особенности: тесты Судан-черный и пероксидазы нормальные, PAS-негативный, позитивные реакции кислотных фосфатаз и эстераз, повышенная деятельность мурамидазы. Эти результаты подтвердили Borsai и сотр. на первом случае, который они наблюдали в нашей стране.

Несколько позже, наряду с упомянутыми цитохимическими и энзиматическими модификациями, стали очевидными отдельные интересные иммунологические связи некоторых из вышеописанных аномалий.

Так например, при аномалии Алиуса-Штейнбринка отсутствуе реакции на пероксидазы в нейтрофилах сопровождается явно пониженной устойчивостью к инфекциям с Candida albicans, выражающейся в опытах, проделанных in vitro тем, что нейтрофилы фагоцитируют патогенных агентов, но не убивают их. Это обстоятельство приближает данную аномалию к синдрому функционального дефицита гранулоцитов.

В недавно описанной сущности — «диссеминированный хронический грануломатоз » — дефицит функции бактериоидии не сопровождается негативированием реакции на пероксидазы.

При аномалии Чедиака-Штейнбринка наблюдается явное отсутствие устойчивости к разного рода инфекциям; иммунологические исследования обнаружили функциональный дефицит нейтрофильного гранулоцита, в том смысле, что если фагоцитарная функция и остается нормальной, химиотаксис и бактерицидность глубоко альтерированы.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Цитологическая клиническая лаборатория


Лаборатория организована в 1994 году в тесном сотрудничестве с НИИ Детской Гематологии России, возглавляемой членом-корреспондентом АМН РФ А.Г. Румянцевым. На базе лаборатории выполнено 6 дипломных работ, 4 кандидатских диссертации, проводятся консультации и обучение специалистов из различных регионов России. В лаборатории работают 3 кандидата наук, 2 врача высшей категории. В настоящее время ведется работа над докторской и 3 кандидатскими диссертациями.

Здесь выполняются следующие виды исследований

Гематологические исследования:

  • Общий анализ крови;
  • Морфологическое и цитохимическое исследование костного мозга;
  • Компьютерная морфометрия эритроцитов;
  • Определение осмотической резистентности эритроцитов;
  • Исследование спинномозговой и других биологических жидкостей;
  • Цитологическое исследование лимфатических узлов, опухолей и опухолеподобных образований;
  • Иммунофенотипирование клеток крови, костного мозга, лимфатических узлов и биологических жидкостей;
  • Подсчет стволовых клеток в трансплантатах кроветворной ткани;
  • Анализ ДНК методом проточной цитофлуориметрии;
  • Исследование кариотипа, ДЭБ-тест на ломкость хромосом.

Лаборатория оснащена современным оборудованием, включающим:

  • Проточный цитофлуориметр с функцией сортировки клеток «EPICS Altra» фирмы «Beckman Coulter», в комплекте со станциями автоматической пробоподготовки «О-РREP» и «DNA-PREP»;
  • Гематологический анализатор «GEN-S-8» фирмы «Beckman Coulter» с модулями для автоматического приготовления и окраски мазков крови;
  • Комплекс автоматизированной микроскопии МЕКОС-Ц2 производства ЗАО «МЕКОС»;
  • Световые и люминесцентный микроскопы фирмы «ZEISS»;
  • Оборудование для стерильных работ и культивирования клеток фирмы «Jouan» и др.

Нозологическая структура исследований, выполняемых в КЦЛ:

  • Врожденные и приобретенные иммунодефицитные состояния;
  • Лейкозы;
  • Лимфомы;
  • Лимфопролиферативные синдромы;
  • Миелопролиферативные синдромы;
  • Нейтропении;
  • Апластические анемии (подозрение на ПНГ);
  • Доноры (кровь, мононуклеарная фракция крови, костный мозг, пуповинная кровь).

Лаборатория оснащена оборудованием:

  • Полуавтоматический гематологичсекий анализатор «Digicell-800» фирмы А/L;
  • Автоматический счетчик крови «Cobas Argos 5 Diff» фирмы «Roche»;
  • Проточный цитометр «РАСScan» фирмы «Becton Dickinson».

Научная деятельность

Клинико-цитологическая лаборатория работает в тесном сотрудничестве с НИИ Детской гематологии России возглавляемой академиком РАЕН, профессором А.Г. Румянцевым и кафедрой лабораторной диагностики ФУВ РНИМУ, консультант — профессор Е.Б. Владимирская; а также с иммунологической лабораторией клиники внутренней медицины им. Вирхова (г. Берлин), возглавляемой профессором С. Серке. На базе лаборатории студенты медико-биологического факультета РНИМУ выполнили 4 дипломных работы. В настоящее время в лаборатории ведется работа над докторской и 6 кандидатскими диссертациями, а 2 врача лаборатории уже имеют степень к.м.н.

Основные направления научных исследований лаборатории включают:

  • Изучение диагностического и прогностического значения дифференцировочных антигенов при остром лейкозе;
  • Анализ резидуального клона при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей;
  • Исследование иммунофенотипа нормальных и патологических фагоцитов;
  • Исследование особенностей кроветворной и иммунной системы детей находящихся в длительной ремиссии острого лимфобластного лейкоза;
  • Влияние хронического вирусного гепатита на гематологические и иммунологические показатели в ремиссии ОЛЛ у детей;
  • Исследование клинико-прогностического и диагностического значения многоростковой дисплазии при остром миелоидном лейкозе у детей.

Ежегодно в лаборатории выполняется около 40 000 анализов. Автоматический анализ крови включает измерение 26 параметров, исследование костного мозга кроме миелограммы включает 8 цитохимических параметров, иммунофенотипирование позволяет охарактеризовать широкий спектр дифференцировочных антигенов кроветворных клеток.

Врачебный персонал

Байдун Людмила Васильевна
Зав. отделением — врач клинической лабораторной диагностики

  • Кандидат медицинских наук
  • Образование: высшее медицинское, окончила 2-ой МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова в 1973 г.
  • Специальность по диплому: «Педиатрия», квалификация: «Врач»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»

Аракелян Лилит Ованесовна
Врач клинической лабораторной диагностики

  • Образование: высшее медицинское, окончила Ереванский медицинский университет им. М. Гераци в 2000 г.
  • Специальность по диплому: «Медико-профилактическое дело», квалификация: «Врач»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»

Атаева Джульетта Михайловна
Биолог

  • Кандидат биологических наук
  • Образование: высшее медицинское, окончила МГУ им. Ломоносова в 1967 г.
  • Специальность по диплому: «Генетика и селекция растений», квалификация: «Биолог-физиолог растений»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»

Галимова Рината Радиковна
Врач клинической лабораторной диагностики

  • Образование: высшее медицинское, окончила Омский государственный медицинский университет в 2016 г.
  • Специальность по диплому — «Медико-профилактическое дело»
  • Сертификаты по специальностям — «Лабораторная диагностика (клиническая)», «Лабораторная генетика»

Леонова Евгения Михайловна
Врач клинической лабораторной диагностики

  • Образование: высшее медицинское, окончила ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова в 2012 г.
  • Специальность по диплому: «Педиатрия», квалификация: «Врач»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»

Николаева Татьяна Валентиновна
Врач клинической лабораторной диагностики

  • Образование: высшее медицинское, окончила Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова в 1993 г.
  • Специальность по диплому: «Лечебное дело», квалификация: «Врач»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»
  • Сертификат по специальности «Клиническая лабораторная диагностика»
  • Квалификационная категория: высшая

Потапов Михаил Александрович
Врач клинической лабораторной диагностики

  • Образование: высшее медицинское, окончил ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ в 2012 г.
  • Специальность по диплому: «Медицинская биохимия», квалификация: «Врач»
  • Сертификат по специальности «Лабораторная диагностика (клиническая)»

Степанова Мария Сергеевна
Врач клинической лабораторной диагностики

Цитохимия и биохимия аномалий клеток крови

Гематология

Гематология – наука, которая изучает заболевания системы кроветворения. За последние 20 лет появились и быстро развиваются новые технологии в области молекулярной биологии и генетики, которые увеличили наши познания о патогенезе онкогематологических и наследственных заболеваний, а также заболеваний, связанных с нарушением гемостаза. Результатом этого явилось создание множества препаратов направленного патогенетического действия, с использованием которых разработаны эффективные программы лечения, увеличившие излечиваемость больных до 95%. Таким образом, современная гематология – это медицина высоких технологий, позволяющая эффективно выявлять и лечить болезни крови.

Анемии

Анемия, или малокровие - патологическое состояние, характеризующееся снижением концентрации гемоглобина в крови (менее 130 г/л у мужчин и 120 г/л у женщин) и гематокрита (менее 39% у мужчин и 36% у женщин), часто при одновременном уменьшении числа эритроцитов (или общего объёма эритроцитов). Различные виды анемий выявляются у 10-20% населения, чаще у женщин, чем у мужчин. Наиболее часто встречаются анемии, связанные с дефицитом железа (около 90% всех анемий), реже - анемии при хронических заболеваниях, еще реже анемии, связанные с дефицитом фолиевой кислоты или витамина В12, гемолитические и апластические. Иногда причиной анемии являются сразу несколько факторов.

Коагулопатии

Коагулопатии — группа заболеваний, обусловленных нарушениями в системе свертывания крови (гемостаза). Гемостаз (система свертывания крови) - комплекс реакций организма, направленных на предупреждение и остановку кровотечения.

У человека может произойти поломка в любом из звеньев гемостаза и на различной его стадии. В зависимости от таких поломок, существуют различные симптомы и клинические проявления коагулопатий.

При нарушениях в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза наиболее частыми клиническими симптомами являются носовые кровотечения, петехиальная сыпь на коже и слизистых оболочках, или противоположная ситуация – гиперагрегационный синдром, который приводит к тромбообразованию, ишемической болезни сердца, инфарктам, инсультам и т.д.

При поломках в коагуляционном гемостазе, коагулопатия (тромбофилия) проявляется различными видами кровотечений, при дефиците хотя бы одного из двенадцати факторов свертывания крови, или гиперкоагуляцией, при нарушении в системе физиологических антикоагулянтов, которая приводит к тромбозам, инсультам, инфарктам, замершей беременности и т.д.

Миелодисплазии

Миелодисплазии включают первичные (идиопатические) и приобретенные нарушения кроветворения. Они развиваются в связи с генетическими аномалиями, вирусными инфекциями, после воздействия ионизирующей радиации, алкилирующих агентов и других химических веществ. В основе этих нарушений кроветворения лежат генетические изменения на уровне полипотентной стволовой клетки гемопоэза, часто проявляющиеся в виде хромосомных аномалий, поэтому последствия этих изменений носят клональный характер, то есть обнаруживаются во всех кроветворных клетках. Частота встречаемости данного заболевания увеличивается прямо пропорционально возрасту, особенно после 60 лет, преобладают мужчины. До 50 лет МДС (миелодиспластический синдром) практически не встречается, за исключением "индуцированных" случаев.

Хронические Ph’-негативные миелопролиферативные заболевания

Классические хронические Ph’-негативные миелопролиферативные заболевания (хМПЗ) – группа болезней, включающая в себя эритремию (истинная полицитемия, ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и идиопатический миелофиброз (ИМФ).

Классические хМПЗ являются хроническими лейкозами с поражением на уровне клетки-предшественницы гемопоэза с характерной для опухоли неограниченной пролиферацией этой клетки, потомки которой дифференцируются по всем росткам кроветворения. При этом для эритремии свойственно преобладание красного ростка, для эссенциальной тромбоцитемии – мегакариоцитов и тромбоцитов. Классические хМПЗ и некоторые другие менее распространенные миелопролиферативные заболевания являются приобретенными, спорадическими нарушениями гемопоэза, однако, известны и наследственные формы миелопролиферативных заболеваний - семейные эритремия и тромбоцитемия. Общие характеристики, которые объединяют эти болезни, включают гиперклеточность костного мозга, склонность к тромбозам и геморрагиям, риск лейкозной трансформации и развитие фиброза в процессе эволюции болезни.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) — онкологическое заболевание лимфатической ткани, характеризующееся накоплением атипичных зрелых лимфоцитов преимущественно в крови, костном мозге, лимфатических узлах, печени и селезенке. При нормальных обстоятельствах клетки крови воспроизводятся контролируемым и организованным образом, а при ХЛЛ В-лимфоциты воспроизводятся без какого-либо контроля и живут слишком долго, что приводит к их избытку в кровотоке. Критерием диагноза является повышение абсолютного числа В-лимфоцитов крови более 5×109/л. При этом лимфоциты должны иметь на поверхностной мембране маркеры CD5, CD23, CD19. Как правило, хронический лимфолейкоз – это медленно развивающееся заболевание, и многие пациенты не нуждаются в каком-либо лечении в течение нескольких месяцев или лет. Но есть пациенты, которые нуждаются в лечении с момента установления диагноза.

Использование цитохимических исследований в лабораторной практике

Цитохимия, как направление гистохимии, изучает химическую природу клеточных структур, распределение химических соединений внутри клетки и их превращения в связи с функцией клетки и ее отдельных компонентов [4]. Основоположником гистохимии считают французского фармацевта, ботаника и микроскописта Франсуа Винсента Распайля (1794–1878 гг.), открывшего многие гистохимические реакции, которые не потеряли своей актульности и сегодня. Однако прошло более ста лет, прежде чем цитохимические исследования начали проводиться систематически и продуктивно. Существенным прогрессом в этой области явилось применение анилиновых красителей (конец XIX – начало XX вв.). Цитохимические методы (определение активности миелопероксидазы, окраска липидов суданом черным В) в гематологии эмпирически начали применяться в первой четверти XX в. Теоретические основы диагностической цитохимии гемобластозов заложены значительно позже – в исследованиях И.Ф. Сейца и И.С. Лугановой, основные результаты их исследований отражены в монографии “Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозах”. Эти ученые впервые показали существование фундаментальных химических и метаболических отличий различных по степени зрелости трансформированных клеток миелоидного и лимфоидного происхождения при хронических лейкозах. Систематическое изучение цитохимических особенностей наименее дифференцированных бластных клеток проведено Hayhoe с соавт. и отечественными гемоцитологами Э.И. Терентьевой, Л.И. Казановой, В.Т. Морозовой, В.Б. Лецким, И.С. Петерсон, Р.В. Ленской [2]. Современная цитохимия основана на химических цветных реакциях, выявляющих в клетках специфические вещества и ферменты. Лейкозные клетки сохраняют свойства своих нормальных аналогов; выявление этих свойств и, благодаря этому, принадлежности лейкозных бластов к определенному клеточному типу, способствует установлению формы острого лейкоза, что необходимо для проведения адекватной и эффективной терапии. Международный совет по стандартизации в гематологии (International Council for Standardization in Haematology – ICSH) рекомендовал для диагностики острых лейкозов исследование диагностически значимых ферментов:

~ неспецифические эстеразы (α-нафтилацетат-эстераза), кислая неспецифическая эстераза, хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D- хлорацетат-эстераза);

~ кислая и щелочная фосфатазы;

и субстанций:

~ гликоген (PAS-реакция) [7].

Цитохимические методы просты в исполнении, информативны и не требуют использования сложной аппаратуры. В настоящее время фирмой ”АБРИС+” выпускаются готовые цитохимические наборы, позволяющие быстро воспроизвести методику и оценить полученные результаты.

Приготовление мазков

Для цитохимических исследований мазки готовят непосредственно из аспирационного материала (костного мозга, периферической крови, лимфатического узла) без добавления антикоагулянта. Если нельзя соблюсти эти условия из-за быстрой сворачиваемости, материал помещают в антикоагулянт (ЭДТА, оксалат, цитрат, гепарин). Предпочтение отдается гепарину, вызывающему наименьшие морфологические изменения лейкоцитов [1]. Оптимальные режимы фиксации, необходимые для сохранения структурных компонентов клеток и закрепления исследуемых веществ в местах прижизненного их расположения, приведены в инструкциях к применению цитохимических наборов.

Количественная оценка

Полученные результаты оцениваются полуколичественным методом, с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Приступая к микроскопии, в каждом отдельном мазке при обзорном просмотре выбирают эталоны – клетки, содержащие исследуемое вещество. Отсутствие окраски цитоплазмы принимается за нулевую степень. Наличие в цитоплазме небольшого окрашенного участка, составляющего 1/4 часть всей цитоплазмы, соответствует интенсивности реакции 1-й степени (А). Окрашивание 8/10 цитоплазмы принимается за 2-ю степень насыщения (В). При 3-й степени интенсивности реакции исследуемое вещество заполняет всю цитоплазму и даже выявляется на ядре. Затем, как при подсчете лейкоцитарной формулы, в разных участках мазка подсчитывают, не пропуская, 100 однотипных клеток и рассчитывают процентное содержание клеточных элементов с различной интенсивностью реакции.

Показатель активности в условных единицах вычисляется по формуле (Astаldi,Verga, 1975 г.):

Средний цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляется по формуле

СЦК = 3С+2В+А

При вычислении показателя активности, клетки с интенсивностью 0 исключаются; к проценту клеток с интенсивностью 1 (А) прибавляется процент клеток с интенсивностью 2 (В), умноженный на коэффициент 2 и количество клеток с интенсивностью 3 (С), умноженное на коэффициент 3. Показатель активности в условных единицах от 0 до 300, СЦК 0–3% [5].

Миелопероксидаза

Принцип цитохимического метода определения миелопероксидазы основан на окислении бензидина в присутствии перекиси водорода в окрашенное нерастворимое соединение желтого цвета. Фермент определяется в 100% нейтрофилов и эозинофилов. При этом миелопероксидаза стабильно сохраняет свою высокую активность при выходе клеток из костного мозга. В моноцитах активность фермента проявляется почти во всех клетках, но интенсивность реакции невысока по сравнению с нейтрофилами. В лимфоцитах, плазмоцитах и клетках красного ряда активность миелопероксидазы не выявляется.

Определение миелопероксидазы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО.

Неспецифические эстеразы

В группу ферментов, гидролизирующих эфиры карбоновых кислот, входят неспецифические эстеразы. Для определения локализации этих ферментов пользуются методом азосочетания. Метод основан на том, что азокраситель, образующийся при сочетании освобождающихся при гидролизе α-нафтола с различными стабилизированными диазотатами, быстро осаждается в месте локализации фермента в нейтральной среде. Наиболее изученные эстеразы – это хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D-хлорацетат-эстераза) и α-нафтилацетат-эстераза.

Хлорацетатэстераза отличается избирательностью ее выявления в клетках гранулоцитарного ряда и в части моноцитов. Максимум активности фермент достигает в промиелоцитах. Выявляется в виде темно-фиолетовых гранул, локализованных в цитоплазме. В лимфоидных и плазматических клетках, в эозинофилах активность хлорацетатэстеразы не выявляется.

Определение хлорацетатэстеразы в лейкоцитах возможно с помощью набора

ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ХЭ.

α-нафтилацетат-эстераза наибольшей активности достигает в промиелоцитах, по мере созревания клеток активность этого фермента падает. Наибольшую активность α-нафтилацетат-эстеразы имеют моноциты крови и костного мозга. Характерной особенностью этой реакции в моноцитах является почти полное ее подавление ингибитором – фтористым натрием. В лимфоцитах активность α-нафтилацетатэстеразы невысока (1–5 гранул в клетке).

Определение α-нафтилацетат-эстеразы в лейкоцитах возможно с помощью

набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-НЭ.

Щелочная фосфатаза – гидролитический фермент с оптимумом действия при рН 9,2–9,6. Метод определения основан на ферментативном гидролизе нафтилфосфата натрия и реакции освобождающегося нафтола с солью диазония. При этом в участке фосфатазной активности образуется осадок синтезированного азокрасителя. Фермент содержится преимущественно в нейтрофильных лейкоцитах.

Определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью на-

бора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ЩФ.

Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом с оптимумом действия при рН 5,0. Кислая фосфатаза содержится во всех клетках крови. Для клеток миелоидной направленности дифференцировки характерно диффузное окрашивание, при этом наименьшая активность обнаруживается в зрелых нейтрофилах. Наибольшей активностью обладают эозинофилы и моноциты. Значительное диффузное окрашивание выявляется в мегакариоцитах и плазматических клетках. Гранулярное окрашивание – в лимфоцитах и ядерных клетках красного ряда.

Определение кислой фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью набора

ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-КФ.

Наличие гликогена в клетке определяют с помощью ПАС- или ШИК-реакции (шифф-йодная кислота) – окисление гликогена йодной кислотой до диальдегидов, которые, взаимодействуя с реактивом Шиффа, образуют нерастворимый продукт красного цвета. Гликоген наблюдается во всех морфологически идентифицируемых миелоидных клетках в виде мелких гранул, расположенных плотно в цитоплазме и на поверхности ядер. Лимфоциты содержат меньше гликогена, чем гранулоциты, но в их цитоплазме часто выявляют ПАС-положительные гранулы. Они могут быть разной величины и их число значительно варьирует.

Определение гликогена в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-

ЦИТОСТЕЙН-ПАС.

Для полуколичественной оценки содержания гликогена в клетках используются следующие градации:

0 – в цитоплазме нет материала;

+ – рассеянные гранулы, или “венчик” из 1 ряда гранул;

++ – венчик из 2 рядов гранул;

+++ – венчик из 3 и более рядов гранул или блоков.

Оценивают 100 клеток, сумма дает итог от 0 до 300.

Липиды локализуются в цитоплазме клеток и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах, для выявления которых пользуются суданом черным В. Выявление липидов основано на способности красящих веществ растворяться в жирах.

Определение липидов в лейкоцитах с помощью судана черного В возможно

с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-СЧ.

Современные цитохимические методы исследований применяются в онкогематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов крови, костного мозга, лимфатических узлов. Различные клеточные линии в цитохимических реакциях демонстрируют неодинаковый характер окраски. Таким образом, цитохимический маркер дает возможность выявить направленность дифференцировки кроветворных клеток. Использование вышеназванных цитохимических методов в большинстве случаев бывает достаточным для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток и определения варианта острого лейкоза.

При определении активности миелопероксидазы интенсивная положительная реакция наблюдается в миелобластах, слабая или отрицательная — в монобластах, лимфобласты остаются неокрашенными. При окрашивании бластных клеток суданом черным В получают данные, дополняющие результаты определения активности миелопероксидазы. Положительная реакция при выявлении активности хлорацетатэстеразы отмечается только в миелобластах. Реакция на неспецифическую эстеразу является маркерной для монобластов и более зрелых клеток моноцитарно/макрофагального ряда. Обнаружение гликогена в виде крупных гранул или блоков в цитоплазме характерно для бластов лимфоидного происхождения. Определение кислой фосфатазы в виде крупной гранулы или пятна в одном участке цитоплазмы позволяет при остром лимфобластном лейкозе отличить бласты Т-клеточной природы от лейкемических клеток, возникающих из В-клеток-предшественников.

При диагностике хронических миелопролиферативных заболеваний немаловажное значение имеет определение активности щелочной фосфатазы при сублейкемическом миелофиброзе, идиопатической полицитемии, бластном кризе хронического миелолейкоза и низкой активности фермента, вплоть до отрицательной реакции, при хроническом миелолейкозе [6]. В некоторых случаях цитохимические реакции позволяют определить принадлежность клеток к опухолевому клону (определение тартратрезистентной кислой фосфатазы при волосато-клеточном лейкозе).

Результаты цитохимических исследований клеток крови при острых лейкозах легли в основу их классификации и способствовали внедрению в практику методов дифференцированной терапии [3].

Список использованной литературы

1. Бутенко З.А., Глузман Д.Ф., Зак К.П. Цитохимия и электронная микроскопия

клеток крови и кроветворных органов. Киев: Изд. “Наукова думка”, 1974.

2. Глузман Д.Ф., Скляренко, Л.М., Надгорная В.А. Диагностика опухолевых забо-

леваний кроветворной и лимфоидной тканей // Здоровье Украины. 2004. № 94.

3. Морозова В.Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л.: Медицина, 1977.

4. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М.: Издательство иностран-

ной литературы, 1962. С. 962.

5. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983.

6. Цитохимическая диагностика в лабораторной гематологии: Методическое

руководство. Атлас. СПб., 2003. С. 38.

7. Scott C.S., Zen Ottolender J.Y., Swirscky D. et al. Recommended procedures for the

classificasion of acute Leukamies // Leukemia and Lymphoma. 1993. V 11. Р. 37–500.

Статья напечатана в журнале справочник заведующего КДЛ №4 опрель 2009 г.

В этом году НПФ «АБРИС+» исполнилось 20 лет. В течении этих лет мы шли к своей цели — обеспечить своих клиентов качественной и доступной продукцией. В 1997 году НПФ «АБРИС+» была удостоена премии «100 лучших товаров России» за производство уникальных красителей для гематологии с торговой маркой "Диахим-ГемиСтейн". Надолба использует поглотительный прибор Качинского, невзирая на действия конкурентов. Солифлюкция, согласно традиционным представлениям, выстраивает композиционный фабульный каркас, таким образом, сходные законы контрастирующего развития характерны и для процессов в психике. Профиль представляет собой композиционный культовый образ, это же положение обосновывал Ж Польти в книге «Тридцать шесть драматических ситуаций». Художественное опосредование, по определению, последовательно. Десукция увлажняет многофазный маркетинг, таким образом, второй комплекс движущих сил получил разработку в трудах А Берталанфи и Ш Бюлера. Взаимодействие корпорации и клиента, как следует из полевых и лабораторных наблюдений, представляет собой клиентский спрос, что лишний раз подтверждает правоту Докучаева.
Солифлюкция, согласно традиционным представлениям, выстраивает композиционный фабульный каркас, таким образом, сходные законы контрастирующего развития характерны и для процессов в психике. Профиль представляет собой композиционный культовый образ, это же положение обосновывал Ж Польти в книге «Тридцать шесть драматических ситуаций». Художественное опосредование, по определению, последовательно. Десукция увлажняет многофазный маркетинг, таким образом, второй комплекс движущих сил получил разработку в трудах А Берталанфи и Ш Бюлера. Взаимодействие корпорации и клиента, как следует из полевых и лабораторных наблюдений, представляет собой клиентский спрос, что лишний раз подтверждает правоту Докучаева.

Читайте также: