Протеомика. Хроматография белков

Обновлено: 18.05.2024

Структурно-функциональные основы протеомики
Методы разделения белков:
хроматография
электрофорез
Методы идентификации белков
Масс-спектрометрия
Методы установления пространственной структуры
белков
Базы данных в протеомике
Интерактомика и протеомика
Клиническая протеомика

3. Литература к курсу

№№
п/п
Список литературы
Год издания
Основная (ЛО)
1.
2.
3.
Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем.
Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии
Финкельштейн, А.В., Птицын, О.Б. Физика белка: Курс лекций с цветными
и стереоскопическими иллюстрациями и задачами.
2005
1999
2005
4.
Twyman, R.M. (2004). Principles Of Proteomics (Advanced Text Series).
2004
5.
Naven T, Westermeier R. (2002). Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of
Proteome Analysis.
2002
6.
Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel R.D., Hochstrasser D.F. (1997). Proteome
Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice).
1997
7.
Palzkill, T. Proteomics
2002
1.
Дополнительная (ЛД)
Vikas Dhingraa, Mukta Gupta, Tracy Andacht and Zhen F. Fu (2005). "New
frontiers in proteomics research: A perspective". International Journal of
Pharmaceutics
1983

4. План лекции

1. Многообразие белков
2. Строение и функционирование белков в
клетке
3. Предпосылки возникновения протеомики
4. Протеомика как постгеномная дисциплина
5. Инструментарий протеомики
6. Приложения протеомики

Структура белков
Аминокислотная
последовательность
Вторичная структура
Третичная структура
Четвертичная структура

Свойства белков
Белки различаются:
По размеру
По заряду (изоэлектрической точке)
По растворимости в воде

8. Размер белковой молекулы

Средний размер молекулы белка у дрожжей
466 аминокислотных остатков – 53 000 а.е.м.
C132983H211861N36149O40883S693
Титин — компонент саркомеров мышц, самый большой из известных
полипептидов
34350 аминокислотных остатков – 2 993 442.763 а.е.м.
Размер белков коррелирует с молекулярной массой, которая
обычно выражается в кДа, 1 кДа=1000 а.е.м.

9. Заряд белковой молекулы

Белки - амфотерные полиэлектролиты
Заряд определяется двумя параметрами:
рН среды и изоэлектрическая точка
Изоэлектрическая точка
в основном - 5,5 до 7,0,
значения лежат в экстремальных областях для специализированных
белков:
пепсин - pI ~ 1, желудочный сок
сальмин - pI ~ 12, протамин молок лосося (высокое содержание аргинина)
Белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами за счёт
электростатического взаимодействия с фосфатными остатками
нуклеиновых кислот, часто являются основными белками.
Примером таких белков служат гистоны и протамины.

10. Растворимость в воде

Большинство белков – растворимы в воде.
• Нерастворимые белки: кератин и фиброин.
гидрофильные и гидрофобные.
• Гидрофильные – большинство белков цитоплазмы, ядра и межклеточного
вещества, в т.ч. нерастворимые кератин и фиброин.
• Гидрофобные - большинство белков, входящих в состав биологических
мембран интегральных мембранных белков, которые взаимодействуют с
гидрофобными липидами мембраны (есть и небольшие гидрофильные
участки).
• Для извлечения гидрофобных белков из мембраны используют метод
солюбилизации детергентами.

11. «Жизненный цикл» белка

Полипептидная цепь
Фолдинг/посттрансляционные
модификации (ПТМ)
ПТМ/транслокации
Регуляторные ПТМ
(фосфорилирование)
Убиквитинирование
Протеосомная деградация
Аминокислоты
Аминоацил-тРНК

12. Функциональные семейства белков

13. Функционально белки связаны между собой в рамках отдельных метаболических путей

• Метаболические белки – катализаторы химических
реакций
• Сигнальные белки – участвуют в передаче сигнала.
• Регуляторные – специфически контролируют
скорость химических реакций или поступления
веществ в клетку
• Структурные
• Транспортные
• Двигательные
• ДНК и РНК связывающие
• Защитные

• Основной метаболизм – 15%
• Структурные белки и синтез белка – 15-20%
цитоскелет, рибосомальные белки, шапероны, белки протеосомы
• Сигнальные и ДНК-связывающие белки – 20-25%
• Функция неизвестна – 40%
Функциональная геномика – поиск функций неизвестных генов
Гены и геномы
Гомологичные
последовательности
называют ортологичными, если к их
разделению привел акт видообразования:
если ген существует у некоего вида,
который дивергирует с образованием двух
видов, то копии этого гена у дочерних
видов
называются
ортологами.
Гомологичные
последовательности
называют паралогичными, если к их
разделению привело удвоение гена: если в
пределах одного организма в результате
хромосомной
мутации
произошло
удвоение гена, то его копии называют
паралогами.

15. Гены и количество экспрессируемого белка

Кол-во молекул белка в клетке - 10-106
Экспрессируется 30-80% от возможных продуктов генома
Кол-во белка в клетке зависит от нескольких факторов:
Скорость транскрипции
Скорость трансляции
Скорость деградации белка
Используемость кодонов
Ala/A GCU, GCC,
GCA, GCG
Leu/L
UUA, UUG, CUU,
CUC, CUA, CUG
Arg/R CGU, CGC,
CGA, CGG,
AGA, AGG
Lys/K
AAA, AAG
Asn/N AAU, AAC
Asp/D GAU, GAC
Cys/C UGU, UGC
Met/M
Phe/F
Pro/P
Gln/Q CAA, CAG
Ser/S
Glu/E GAA, GAG
Thr/T
Gly/G GGU, GGC,
GGA, GGG
Trp/W
AUG
UUU, UUC
CCU, CCC, CCA,
CCG
UCU, UCC, UCA,
UCG, AGU, AGC
ACU, ACC, ACA,
ACG
UGG
His/H CAU, CAC
Ile/I AUU, AUC,
AUA
START AUG
Tyr/Y
Val/V
STOP
UAU, UAC
GUU, GUC, GUA,
GUG
UAG, UGA, UAA

Посттрансляционная
модификация
—
это
химическая модификация белка после его трансляции.
Это одна из последних стадий процесса биосинтеза
белка для многих белков.
ацетилирование
фосфорилирование
гликозилирование
изменение природы аминокислоты
метилирование
протеолиз

17. Белки – «модульные» соединения

Домен – часть белковой молекулы, имеющая собственную
3D структуру.
Независимая структурная единица.
Может эволюционировать независимо от остального белка
На основании доменной структуры белки подразделяются на
семейства
Примеры доменов: Zn-пальцы, домены иммуноглобулинов

18. Масштабные направления

геномика - геном
транскриптомика - транскриптом
метаболомика - метаболом
цитомика - цитом
пептидомика - пептидом

19. Зачем нужна протеомика?

Геном
-
Транскриптом
-
Протеом
из: Graves and Haystead, 2002
• Несколько уровней регуляции ген-функция
• Белки – молекулы, реализующие физиологический эффект
Одни и те же гены, но.

23. 2.Что такое протеом?

24. Задачи протеомики

Протеомика: цель и задачи
Цель протеомики - идентификация, характеристика и
количественный учет ВСЕХ белков метаболического пути,
органеллы, клетки, ткани, органа и всего организма.
Объект исследования - протеомы
Задачи протеомики
1) идентификация белков
2) количественное определение белков
3) дифференциальный анализ
4) анализ белок-белковые взаимодействий (с интерактомикой)
5) установление характера посттрансляционных модификаций
6) структурный анализ белков протеома
7) экспериментальная биоинформатика в области протеомики (создание и
усовершенствование существующих экспериментальных и биоинформационных
методов и выявление новой информации и создание новых баз данных о белках)
7) поиск биомаркеров патологических процессов
8) установление механизмов возникновения заболеваний на молекулярном уровне

Протеомика конкретных биообъектов
протеомика плазмы крови,
протеомика микроорганизмов
протеомика новообразования
Протеомика
Протеомика как методология

26. Протеомика и геномика

ДНК
Статична
Может быть
амплифицирована
Простота строения (1компонент)
Хорошая растворимость
Белки
Очень динамичны
Не может быть
амплифицирована
Высокая сложность
строения (модификации)
Растворимость
различная
Полностью изучен ряд геномов, но до сих пор полностью
не охарактеризован ни один эукариотический протеом

Протеомика и химия белка
Белковая химия
Протеомика
Индивидуальные белки
Сложные смеси белков
Полный анализ
последовательности
Частичный анализ
последовательности
Акцент на структуре и функции
Акцент на идентификации по
базам данных
Структурная биология
Системная биология

28. Кто занимается протеомикой

2001 Международная организация по изучению протеома
человека (Human Proteome Organization / HUPO).
Chromosome
Group Leader
National Affiliations
1
Fuchu He
China
2
Lydie Lane
Switzerland
3
Toshihide Nishimura
Japan
4
Yu Ju Chen
Taiwan
5
Rainer Bischoff
Netherlands
6
Paul Keown
Canada
7
Mark Baker
Australia, New Zealand
8
Pengyuan Yang
China
9
Je-Yoel Cho
Seoul, Korea
10
Joshua Labaer
USA
11
Jong Shin Yoo
Korea
12
Visith Thongboonkerd
India, Singapore, Taiwan,
Thailand
13
Young Ki Paik
Korea
14
Jérôme Garin
France
15
Gilberto B Domont
Brazil
16
Juan Pablo Albar
Spain
17
Bill Hancock
USA
18
Alex Archakov
Russia
19
Gyorgy Marko Varga
Sweden
20
Siqiu Liu
China
21
Daniel Figeys
Canada
22
Charles Lee
USA
X
Tadashi Yamamoto
Japan
Y
Hosseini Salekdeh
Iran
MT
Andrea Urbani
Italy
Деятельность: реализация проекта
«Протеом человека» (HPP)
«Хромосомный» подход к протеомике
Интеграция и обработка данных в
швейцарском институте
биоинформатики (SIB), Женева
Journal of Proteome Research
(January 4, 2013, Volume 12, Issue 1)

29. Инструментарий протеомики

30. Методы протеомики

Методы разделения белков
Методы идентификации белков
Методы количественного анализа белков
Методы
накопления,
хранения
и
обработки полученной информации

31. Методы разделения

SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
Изоэлектрическое фокусирование
Двумерный электрофорез
Хроматография

32. Методы идентификации белков

750
1000
1250
1500
1750
1612.7
2000
2250
2869.3
2290.0
2735.1
2097.0
2147.8
2201.1
2005.7
1794.7
1273.7
1096.6
0.5
1198.7
976.4
1929.9
687.4
1849.7
1490.7
1546.8
1125.7
902.5
878.5
Intens. [a.u.]
Методы идентификации белков
• Масс-спектрометрия
• Иммуноблоттинг
x10 4
1.5
1.0
0.0
2500
2750
3000
m /z

33. Обработка информации - биоинформатика

Биоинформатика - использование математических средств для извлечения
полезной информации из «шумных» или слишком объёмных данных о
структуре ДНК и белков, полученных экспериментально.
Биоинформа́тика
1. математические методы компьютерного анализа в сравнительной
геномике (геномная биоинформатика).
2. разработка алгоритмов и программ для предсказания пространственной
структуры белков (структурная биоинформатика).
3. исследований стратегий, соответствующих вычислительных методологий,
а также общее управление информационной сложности биологических
систем.
Биоинформатика помогает связать
геномные и протеомные проекты, к
примеру, помогая в использовании
последовательности
ДНК
для
идентификации белков.

34. Дифференциальная экспрессия генов

• 2D-гель электрофорез и масс-спектрометрия способны дать качественную и
количественную информацию о поведении отдельных белков
• наиболее часто используемый подход в протеомном анализе
from: Pandey and Mann, 2000

Клиническое и биомедицинское применение
протеомики
• Клинические применения 2-D PAGE & MS
– Идентификация происхождения образцов жидкостей организма и
образцов тканей, полученных биопсией.
– Анализ белковых фенотипов и посттрансляционных
модификаций в жидкостях, клетках или тканях.
– Изучение клональности иммуноглобулинов и определение
клонов, которые не могут быть определены обычными методами.
– Наблюдение за процессом течения болезни и экспрессией белков.
– Определение новых биомаркеров болезней и/или шаблонов в
клетках и тканях.

Клиническое применение
2-D электрофореза
• Физиологические жидкости
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Клетки крови
Плазма и сыворотка
Моча
Цереброспинальная
жидкость
Амниотическая
жидкость
Синовиальная
жидкость
Слюна
Пот
Слезная жидкость
• Твердые ткани
–
–
–
–
Сердце
Мозг
Щитовидная железа
Мышца
• Злокачественые опухоли
• Культура тканей
• Малигнизированные
клетки
• Бактериальные белки
Young & Tracy Journal of Chromatography A, 698 (1995) 163-179

37. Прикладная протеомика

Поиск и обнаружение биомаркеров
Установление молекулярных механизмов
возникновения заболеваний
Ранняя диагностика заболеваний
Аннотация геномов
Эволюционный анализ
Идентификация видовой принадлежности

38. Биомаркеры

39. Использование биомаркеров

Прогнозирование индивидуального риска заболеваний
у здоровых лиц.
Оценка нормальных физиологических процессов в
организме (рост, вес, спортивная форма, протекание
беременности, старение).
Выявление заболеваний, подбор лечения, оценка его
эффективности.
Прогнозирование течения и исхода заболевания.
Определения негативных эффектов внешней среды, в
том числе химических отравлений, радиационного
облучения и др.
Разработка новых лекарственных средств.

40. Виды биомаркеров

• Предупредительные
Используются для выявления лиц с повышенным риском возникновения заболевания по уровню
содержания в организме тех или иных веществ.
Высокий уровень ЛПНП может указывать на высокий риск развития атеросклероза.
• Верификационные
Подтверждающие заболевания на субклинической стадии.
Микроальбуминурия появляется у лиц с сахарным диабетом ещё до того, как появятся первые
клинические проявления.
• Диагностические биомаркеры
Используются для идентификации определенного заболевания.
Повышение концентрации тропонина в крови указывает на инфаркт миокарда, а
гликолизированного гемоглобина — на сахарный диабет.
• Биомаркеры состояния
Используются для определения тяжести заболевания.
Мозговой натрийуретический пептид — для определения функционального класса застойной
сердечной недостаточности.
• Прогностические.
Используются для оценки прогноза развития заболевания, его возможного исхода и оценки
эффективности лечения. Например, биомаркеры рака при опухолях или гликозилированный
гемоглобин при диабете.
• Фармакодинамические биомаркеры.
Используются при разработке лекарств и выявляют определенный фармакологический ответ, что
необходимо при исследованиях по оптимизации дозировок лекарств.

42. Заключение

• Протеом — совокупность белков биообъекта.
• Протеомика — изучает белки и их взаимодействия в живых организмах.
• Цель протеомики - интегральное изучение поведения и функций клеточных
белков в живой клетке
• Задачи протеомики:
– каталогизация всех белков, синтезируемых различными типами клеток;
– выяснение характера влияния возраста, условий окружающей среды и заболеваний на
синтезируемые клеткой протеины;
– выяснение функций идентифицированных белков;
– составление схем связей между повышением или понижением уровня синтеза белков и
происходящими в организме процессами, например, при развитии заболевания, инфицировании
организма или биохимическими реакциями сельскохозяйственного растения, происходящими в
ответ на нападение насекомых;
– изучение взаимодействий различных белков с другими белками, содержащимися внутри клетки
и во внеклеточном пространстве.
• Основная методология
– двумерный электрофорез
– хроматография
– масс –спектрометрия
- биоинформатика

Протеомика. Хроматография белков

Протеомика занимается исследованием белков, экспрессируемых геномом. Геномику и протеомику следует рассматривать как комплементарные компоненты генетического профиля, начиная с ДНК и заканчивая модифицированными белками.

Белки служат конечными продуктами генома человека и в итоге определяют его биологию. Белки ответственны за биологическую форму и функцию. Ученые подсчитали, что количество белков у человека (200 тыс.) в 6-7 раз больше, чем генов, что обусловлено сплайсингом, изменениями структурных кассет среди генов в процессе транскрипции и посттрансляционными модификациями белков. Задача протеомики состоит в расшифровке сложных взаимодействий всех белков, экспрессирован-ных в ткани или организме в норме и при патологии.
В настоящее время протеомика находится в стадии становления.

Методы анализа протеома пока только разрабатывают и проверяют, но уже известно 5 основных элементов любого протеомного анализа: забор образца, экстракция белков, разделение белков, определение аминокислотной последовательности белка (секвенирование) и сравнение полученной последовательности с референсными базами данных по идентификации белков. Забор образца — обычная процедура получения биологического материала (биоптата ткани или плазмы крови от конкретного человека при наличии письменного информированного согласия).

Для экстракции белков в целях освобождения от ДНК, РНК, углеводов и липи-дов обычно используют химические методы, в основном метанол. Далее для идентификации экстрагированные белки разделяют; этот этап традиционно выполняют с помощью двухмерного электрофореза в геле. В одном направлении белки разделяются в зависимости от их массы, а в другом — тто изоэлектрической точке или заряду. Поскольку в большинстве пятен на пластинке с гелем после двухмерного электрофореза присутствует множество белков, исследователи применяют и другие методы разделения и идентификации белков, включая жидкостную хроматографию.

При жидкостной хроматографии для разделения белков в зависимости от их биохимических свойств, в т.ч. по молекулярной массе, изоэлектрической точке или гидрофобности, используют твердофазную или жидкофазную среду. Разделение с помощью жидкостной хроматографии можно проводить последовательно в несколько серий, что улучшает разрешающую способность метода.

Для повышения чувствительности и специфичности разделения белков используют другие виды хроматографии, например аффинную хроматографию, при которой колонка заполнена носителем, содержащим антитела, специфичные к определенным функциональным участкам белков; такой подход позволяет достичь желаемой степени разделения белков. После разделения белки идентифицируют; обычно для этой цели применяют некоторые виды масс-спектрометрии.

При масс-спектрометрии белки или пептиды превращаются В заряженные частицы, которые можно разделить в зависимости от характерного для них соотношения массы и заряда. Применяют несколько типов масс-спектрометрической ионизации: электроспрей, или ионизация распылением в электрическом иоле; матричная активированная лазерная десорбция/ионизация MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization). Пептидные последовательности, идентифицированные с помощью указанных методов, сравнивают с известными базами данных для однозначной идентификации белка.

После идентификации белка в протеоме определяют его относительный уровень и сравнивают с таковым в норме и при патологии. Наконец, тщательный анализ протеома должен включать оценку функциональной активности данного белка либо в культуре клеток, либо на животных моделях. Такой подход аналогичен анализу генома, где критичным является определение значимости гена или его мутации путем оценки его функциональной активности.

Анализ протеома в настоящее время имеет ряд ограничений: чувствительность, специфичность и пропускная способность методов. Однако эти направления и применяемые методы быстро развиваются. Возможности протеомики в изучении ССЗ представляются весьма многообещающими для понимания функционирования сердечно-сосудистой системы во всей ее сложности.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Протеомика

Протеомика — исследование белковых молекул, их аминокислотной последовательности, пространственной структуры, посттрансляционных модификаций. В центре это направление представлено оборудованием для масс-спектрометрии, хроматографии, анализа биомолекулярных взаимодействий.

Имеющееся оборудование для масс-спектрометрии может быть использовано для поисковых и полуколичественых исследований, идентификации одновременно нескольких белков или пептидов в составе сложных смесей, определения аминокислотной последовательности белков, наличия посттрансляционных изменений, выявления и идентификации биомаркеров различной органической природы, проведения молекулярной визуализации тканей, идентификации микроорганизмов.
Хроматографическое оборудование позволяет разделять белки и пептиды в составе сложных смесей по ряду параметров, проводить очистку интересующего белка, проводить оценку качества очистки белков и олигонуклеотидов.
Анализ биомолекулярных взаимодействий, поиск и ранжирование антител, картирование эпитопов, изучение взаимодействий белков другими белками, малыми молекулами и нуклеиновыми кислотами в растворе проводится на установке использующей эффект поверхностного плазмонного резонанса. Определение скорости диффузии белков, их концентрации и взаимодействия в живых клетках может быть проведено на конфокальном микроскопе, оснащённом для флуоресцентной корреляционной спектроскопии.
Определение пространственной структуры изучаемых белков и их комплексов в нативном гидратированном состоянии возможно с использованием метода витрификации на сеточках (bare-grid plunge freeze) и последующей электронной микроскопии с анализом единичных частиц (single particle analysis).
Для пробоподготовки образцов к исследованию на сложном аналитическом оборудовании в центре предусмотрено рутинное оборудование для гомогенизации и лизиса образцов, их очистки и концентрации, фракционирования при помощи хроматографии, одномерного и двумерного электрофореза, иммуноблоттинга, препаративного электрофореза.
Некоторые задачи структурной протеомики, такие, как исследование с применением рентгено-диффракционного подхода, ядерно-магнитного резонанса, а также задачи, требующие значительных вычислительных ресурсов могут быть решены при помощи оборудования, представленного в других ресурсных центрах СПбГУ.

Масс-спектрометрия

Жидкостный хромато-масс-спектрометр с электроспрейной ионизацией (ESI) Agilent 6538 UHD
Масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ, MALDI) Bruker Ultraflextreme

Хроматография

Высокоэффективный нанопоточный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ, HPLC) Dionex UHPLC+ UltiMate 3000 Nanoflow
Коллектор фракций для нанесения на МАЛДИ-мишени Bruker proteineer fcII
Высокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1260
Хроматографическая полупрепаративная система FPLC BioRad NGC Discovery

Биомолекулярные взаимодействия

Блок реализации детекции отдельных молекул включая методы времени затухания флуоресценции (FLIM), флуоресцентной корреляционной (FCS) и кросс-корреляционной (FCCS) спектроскопии Leica SMD FLCS

Исследование пространственной структуры белков

Просвечивающий электронный микроскоп 40-120 кВ Jeol JEM-1400
Просвечивающий электронный микроскоп 80-200 кВ Jeol JEM-2100HC
Устройство для витрификации биологических макромолекул и клеточных органелл на сеточках Leica EM GP

Исследование пространственного распределения белков в клетках и тканях

Система автоматического иммунофлуоресцентного окрашивания и постановки FISH Tecan GenePaint EVO 150/4
Система нанесения матричного раствора для молекулярной гистологии Bruker ImagePrep
Вибратом Leica VT1200S,
Прямой микроскоп с оборудованием для лазерной микродиссекции материала Leica LMD 7000

Программное обеспечение

Программное обеспечение для анализа двумерных гелей BioRad PDQuest
Поиск и идентификации пептидов MASCOT
Программное обеспечение для анализа последовательностей белков и сопоставления их с геномной информацией DNAstar lasergene 10

Электрофорез и документация

Высокоразрешающий лазерный сканер гелей GE Typhoon 9500FLA
Денситометр BioRad GS-800
Универсальная система гель-документации BioRad ChemiDoc MP
Препаративный электрофорез BioRad PrepCell
Препаративная изоэлектрофокусировка BioRad Rotofor
Полусухой блоттер BioRad Trans-Blot
Электрофоретическое оборудование блоки питания BioRad PowerPak Universal, BioRad PowerPak HC, камеры BioRad mini-protean
Каппилярный электрофорез (SDS-PAGE на чипе) Agilent bioanalyzer 2100
Устройство для автоматического прецезионного вырезания участков из гелей и мембран BioRad ExQuest

Пробоподготовка

Сканирующий спектрофлуориметр Agilent (Varian) Cary Eclipse
Система нанесения матричного раствора для молекулярной гистологии Bruker ImagePrep

Комплексное решение для очистки белков с центрифугой Avanti JXN

Препараты белков высокой степени очистки требуются при выполнении многих задач протеомики, таких как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия и биохимический анализ in vitro. Белки могут быть выделены из тканей или, что используется чаще, путем экспрессии в живых организмах, например, в культуре бактерий, дрожжей или клеток млекопитающих. Уникальные характеристики молекул белка, такие как аминокислотный состав, размер, форма, изоэлектрическая точка и растворимость используются для разработки уникальной стратегии выделения каждого конкретного белка. При этом главной задачей является получение максимального количества целевого белка с минимальным содержанием примесей.

Центрифугирование – это важный и, как правило, первый этап протокола очистки белка. Центрифуги серии Avanti JXN позволяют упростить работу на любой стадии выделения. За счет широкого выбора роторов, отличающихся различной вместимостью и максимальным ускорением, эти центрифуги являются универсальным инструментом, удовлетворяющим требованиям любой лаборатории протеомики. Центрифуги превосходно подходят для решения различных задач, таких как осаждение клеток, преципитация белков, выделение субклеточных компонентов и мембран, разделение в градиенте плотности и концентрирование белков.

Типовая схема очистки экспрессированных белков:

Осаждение клеток. Осаждение клеточного материала, из которого будет выделяться целевой белок (например, бактерий, клеток насекомых, клеток млекопитающих, тканей и т. п.) это первый этап очистки белка. На этом этапе, как правило, требуется ротор большой емкости с невысокой максимальной скоростью. Для решения этой задачи в центрифугах серии Avanti JXN хорошо подходят угловые роторы JLA-8.1000/JLA-9.1000/JLA-10.500 емкостью до 6 литров. Если необходимо получить еще больше материала, например, при промышленном производстве биопрепаратов, можно использовать проточный ротор JCF-Z.
Очистка лизата. После осаждения и лизиса клеток вторым важным этапом очистки является эффективное отделение белка от небелковых компонентов и разрушенных клеток. На данном этапе требуется высокоскоростной ротор небольшой емкости. Для выполнения этой задачи в центрифугах серии Avanti JXN используются роторы JA-25.15, JA-25.50 и JA-30.50 Ti, развивающие ускорение более 100 000 g.
Грубая очистка. Преципитация с помощью сульфата аммония, полиэтиленгликоля и других веществ позволяет извлечь белок из грубого экстракта. Этот этап представляет собой первичную очистку белка. Отделение белковых преципитатов выполняется при средних скоростях в роторах малой или средней емкости. На данном этапе в центрифугах серии Avanti JXN можно использовать роторы JA-17, JA-18, JA-20 и JLA-16.250, которые обладают необходимым сочетанием характеристик.
Хроматографические колонки. Вторичная очистка белка, как правило, основана на использовании различных хроматографических методов, таких как аффинная, ионообменная, гидрофобная хроматография, гель-фильтрация и т.д. Наборы микроцентрифужных спин-колонок для выделения в 96-луночных планшетах позволяют легко и быстро очистить небольшое количество рекомбинантного белка. Данные колонки прекрасно подходят для подбора идеальных условий хроматографии, а также могут применяться в высокопроизводительных приложениях протеомики. Роторы JS-5.3 и JS-5.9 позволяют выполнять колоночную препаративную хроматографию белков в 96-луночных планшетах.
Градиент плотности. Градиенты плотности часто используются для получения субклеточных органелл, таких как митохондрии, плазматические мембраны и т.д., из которых требуется выделить нужный белок. Градиенты плотности также используются в качестве третьего этапа очистки белков. Роторы JS-24.15 и JS-24.38 можно использовать как для изопикнического, так и для зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности.
Замена буфера и концентрирование. При выполнении любых исследований в области протеомики обязательным условием является концентрирование чистого белка и использование правильного буфера. Существуют различные фильтр-колонки, позволяющие заменить буфер и выполнить концентрирование белка. В роторах JS-4.0, JS-4.3 и JS-5.3 для данных концентраторов предусмотрены различные адаптеры.

Замечание: В зависимости от адаптера, лабораторных принадлежностей и модели центрифуги, максимальная скорость и вместимость ротора могут отличаться от указанных. Точная информация приводится в соответствующих руководствах для ротора/центрифуги.

Протеомика. Хроматография белков

Для того чтобы изучать свойства и функции определенного соединения в живых организмах (например, какого-то конкретного белка), необходимо выделить его в чистом виде. Однако в живых клетках и тканях имеется огромное количество разных белков и других органических соединений. В биохимии используются различные методы для разделения этих сложных смесей.

До сих пор широко используются способы разделения, основанные на различиях в растворимости веществ. Так, липиды хорошо растворяются в гидрофобных растворителях – хлороформе, эфире и др., тогда как белки, углеводы и другие гидрофильные вещества в них не растворимы. В свою очередь разные белки имеют различную растворимость в смесях воды и органических растворителей (спирта, ацетона др.) с разной концентрацией. Все белки плохо растворимы в растворах с очень низким рН, например, в 1 М HClO₄, что позволяет осаждать их из биологических смесей, однако при этом происходит необратимая денатурация белков.

Более мягким, не повреждающим способом является высаливание – осаждение белка высокими концентрациями солей, как правило, сульфатом аммония. Однако кривые растворимости многих белков проходят близко друг к другу, и чисто разделить их таким способом не удается. Как правило, высаливание применяется на ранних этапах очистки, а для последующего тонкого разделения применяются другие методы.

Одним из таких методов является хроматография. В ее основе лежит использование специальных нерастворимых матриц-сорбентов, способных связывать различные вещества из раствора. Принцип разделения состоит в том, что разные вещества из сложных биологических смесей имеют разное сродство к этому нерастворимому сорбенту. При промывании такой матрицы растворителем вещества с низким сродством к сорбенту будут вымываться первыми, с более высоким – вторыми и т. д.

Существует несколько разновидностей хроматографии – адсорбционная, ионообменная и др. Сам метод был изобретен русским ученым М. С. Цветом. Он разделял растительные пигменты (хлорофиллы и каротиноиды) на основе их различного сродства к порошку мела. Пигменты образовывали на колонках с мелом цветные полоски с разной окраской, что и позволило назвать метод хроматографией (по-гречески χρωμα означает «цвет», по другой версии метод получил название по фамилии изобретателя). Этот вид хроматографии называется адсорбционной – разделяемые вещества сорбируются на носителе благодаря ван-дер ваальсовым силам (их природа здесь не рассматривается, про них можно прочитать в учебниках физики). Недостатком адсорбционной хроматографии является невозможность предсказать, какое вещество прочнее свяжется с сорбентом, а какое слабее, это приходится устанавливать опытным путем.

Для проведения ионообменной хроматографии используют ионообменники. Это нерастворимые в воде гранулы, на поверхности которых имеются электрические заряды. В качестве примера можно привести карбоксиметилцеллюлозу. Для ее получения гранулы обычной целлюлозы размером 40–80 микрон обрабатывают таким образом, что часть гидроксильных групп превращается в карбоксильные. В водной среде они диссоциируют, отдавая ион H + : R–COOH ↔ R–COO – + H +

Допустим, у нас имеется смесь трех белков с изоэлектрическими точками 5,5; 6,5 и 7,5. При рН 5 все они будут иметь положительный заряд и связываться с ионообменником за счет электростатических сил. Если повысить рН до 5,5, то первый белок достигнет изоэлектрической точки, перестанет связываться с карбоксиметилцеллюлозой, и его можно будет отделить от остальных белков. Если после этого поднять рН до 6,5, то с ионообменника будет удален второй белок, а третий можно удалить, повысив рН до 7,5.

Снимать белки с ионообменника можно изменением не только рН, но и концентрации ионов в растворе. При рН 5 у первого белка будет наименьший заряд, и он связывается с карбоксиметилцеллюлозой слабее других. Если добавить к ионообменнику раствор KCl невысокой концентрации, то ионы K + будут вытеснять первый белок, а второй и третий при этом еще будут связаны с ионообменником. При дальнейшем повышении концентрации KCl можно удалить второй белок, а затем и третий. Для проведения хроматографии используют также и анионообменники.

Практически ионообменную хроматографию проводят следующим образом. Суспензию гранул ионообменника наливают в специальный цилиндрический сосуд – колонку. На дне колонки есть отверстие, а над ним расположена мелкопористая сетка, через которую не проходят гранулы, но свободно протекают растворы. Суспензии дают осесть и промывают, пропуская через колонку соответствующий раствор. Затем наносят смесь разделяемых веществ (например, белков) и проводят отмывку от несвязавшихся с ионообменником. Наконец, последовательно пропуская растворы с различной ионной силой и разным рН, снимают с колонки нужные белки.

Ионообменная хроматография позволяет разделять вещества по электрическому заряду. Другой метод, гель-проникающая хроматография, служит для разделения различных молекул по молекулярной массе и размеру.

Для гель-проникающей хроматографии колонку заполняют суспензией гранул, в которых имеются поры определенных размеров. Обычно это гранулы нерастворимого полисахарида декстрана. Крупные молекулы не могут заходить в поры этих гранул, а мелкие – могут. Если на колонку нанести смесь белков разной молекулярной массы, а затем пропускать через нее промывающий раствор, то самые крупные белки, не входящие в поры, почти не будут задерживаться в колонке и выйдут первыми. Молекулы с меньшей молекулярной массой будут задерживаться в колонке, диффундируя внутрь гранул. Чем меньше молекулярный вес белка, тем позже он выйдет с колонки.

Жидкость, вытекающую из колонки и содержащую разделенные белки, собирают в отдельные пробирки. Содержание белка там определяют с помощью специфических реакций или измеряя поглощение ультрафиолета (см. урок 5). Существуют специальные анализаторы, которые измеряют поглощение ультрафиолетового света прямо в токе жидкости, стекающей с колонки, и регистрируют его с помощью самописца. С их помощью можно каждый выходящий из колонки белок собрать в отдельную пробирку.

Для проведения хроматографии не обязательно использовать колонку. Можно нанести тонкий слой сорбента на плоскую пластинку и закрепить его там (например, специальным клеем). Небольшое количество исследуемого образца наносят на пластинку, высушивают, и помещают эту пластинку в специальную камеру, на дно которой налито немного растворителя. Благодаря капиллярным силам раствор элюента поднимается вверх по пористой пластинке. При этом разные химические вещества, содержащиеся в нанесенных образцах, имеют различное сродство к сорбенту, «цепляются» за него с разной силой и поэтому движутся с разной скоростью. Как только фронт растворителя дойдет почти до верхнего края, пластинку вынимают и высушивают. Для обнаружения разделившихся веществ пластинку обрабатывают специфическими красителями (например, для обнаружения аминокислот – нингидрином). Разные вещества при этом оказываются на различных расстояниях от точки нанесения, что позволяет идентифицировать их.

Этот вариант метода получил название тонкослойной хроматографии. Обычно тонкослойную хроматографию применяют для анализа небольших количеств веществ, а колоночную – для обработки больших препаратов. Чаще всего используют пластинки с носителем для адсорбционной хроматографии (SiO₂ или Al₂O₃ или целлюлозой), иногда – ионообменной.

Рис. 3. Пластинка для тонкослойной хроматографии с нанесенными образцами (слева). При погружении пластинки в растворитель, налитый на дно камеры (2-й слева), он постепенно пропитывает пластинку и движется вверх (3-й слева), при этом происходит разделение содержащихся в образце веществ. После обработки красителем пятна отдельных веществ можно увидеть (справа)

Еще один метод разделения биологических веществ – электрофорез. В основе его лежит движение молекул в электрическом поле. В ранних вариантах метода биологические смеси наносили на бумажную полоску, пропитанную буферным раствором, и присоединяли концы полоски к катоду и аноду. Под действием электрического поля разные молекулы двигались в разных направлениях и с разными скоростями. Направление движения молекул определялось знаком суммарного заряда молекулы данного вещества при выбранном рН буферного раствора, а скорость движения – величиной этого заряда. После того, как самое «быстрое» вещество дойдет до конца полоски, электрический ток выключали, и вещества с различным зарядом молекулы оказывались в разных участках бумажной полоски.

Количество смеси веществ, которое можно разделить с помощью электрофореза, обычно бывает невелико, поэтому данный метод чаще используют для анализа, а не для препаративного выделения нужного вещества.

Электрофорез на бумаге сейчас не используется, его заменил более современный вариант – электрофорез в геле. По своей консистенции гель похож на студень или на мармелад: это твердое эластичное вещество, состоящее из длинных нитей полимера, между которыми свободно перемещается вода и небольшие ионы.

Электрофорез часто проводят в гелях агарозы – полисахарида, похожего по свойствам на крахмал, но состоящего из других моносахаридов и неразветвленного. Гранулы агарозы образуют в водных растворах суспензию. При нагревании почти до кипения водородные связи между молекулами агарозы разрываются, и она растворяется. Раствор агарозы выливает на пластинку и дают остыть. При понижении температуры вновь образуются водородные связи между молекулами агарозы, и раствор превращается в студнеобразный гель (сравните с водными растворами крахмала, см. урок 3).

К краям пластинки с гелем присоединяют катод и анод и включают электрический ток. Под действием электрического поля молекулы будут двигаться в соответствии со своим зарядом. Следует отметить, что при электрофорезе в геле происходит разделение макромолекул не только по заряду, но и по размеру молекулы. Полимерные цепочки геля образуют пространственную решетку, через которую приходится «протискиваться» белкам и нуклеиновым кислотам. Крупные молекулы будут часто ударяться об эту решетку, что сильно замедлит их движение, молекулы среднего размера будут ударяться не так часто, и эффект замедления скажется меньше, а мелкие молекулы почти не будут ударяться о решетку.

Для того чтобы следить за протеканием электрофореза, к разделяемой смеси обычно добавляют специальный лидирующий краситель – вещество, которое будет двигаться быстрее самой быстрой макромолекулы. Как только он дойдет до конца пластинки геля, ток выключают.

Для того чтобы увидеть результаты электрофореза, существует несколько способов. После проведения электрофореза ДНК гель вымачивают в растворе бромистого этидия. Молекулы этого вещества встраиваются между парами азотистых оснований в двойную спираль ДНК. Если теперь осветить ДНК ультрафиолетом, то бромистый этидий будет флуоресцировать – светиться оранжевым светом. Светящиеся оранжевые полоски представляют собой молекулы двухцепочечной ДНК разного размера.

Для белков применяют другой способ. Гель обрабатывают красителем, молекулы которого связываются с белковой глобулой (обычно это кумасси ярко-синий, о котором говорилось на 5-м уроке). После этого гель отмывают от несвязавшегося красителя, и окрашенные полоски белка становятся хорошо видимы невооруженным глазом.

Для того чтобы увидеть местоположение ферментов в геле, применяют окраску по активности. Гель вымачивают в растворе, содержащем субстрат интересующего нас фермента. Субстрат берут не любой, а такой, чтобы в ходе ферментативной реакции давал нерастворимый окрашенный продукт. В результате в тех местах геля, где есть исследуемый фермент, появятся полоски окрашенного продукта. Для диагностики целого ряда заболеваний применяют электрофорез сыворотки крови с последующей окраской на фермент лактатдегидрогеназу. У здоровых людей в крови преобладает 2-я изоформа этого фермента, у больных инфарктом миокарда при разрушении сердечной мышцы в кровь выходит много 1-й изоформы, а у больных гепатитом из погибших клеток печени освобождается много 4-й и 5-й изоформ.

Существует вариант метода электрофореза в геле, позволяющий разделять белки строго по молекулярной массе, без всякого влияния изоэлектрической точки – это электрофорез в додецилсульфате натрия (ДДС). ДДС состоит из длинного гидрофобного хвоста и отрицательно заряженной (в водной среде) головки. Гидрофобные хвосты молекул ДДС связываются с молекулами белка (с 1 г белка связывается около 1,4 г ДДС), а отрицательно заряженные головки придают всей глобуле отрицательный заряд. Поскольку с каждой белковой молекулой связывается множество молекул ДДС, то собственный заряд аминокислотных остатков уже не имеет значения.

После обработки ДДС белковая молекула приобретает отрицательный заряд, причем, чем крупнее белок, тем заряд больше. Соотношение заряда к массе у всех белков становится одинаковым, и теперь скорость их движения зависит только от трения о пространственную решетку геля. Оно определяется размерами белка: чем крупнее белок, тем медленнее он будет двигаться в геле. К сожалению, обработка ДДС вызывает денатурацию белковых молекул и необратимую потерю ферментативной активности.

В противоположность электрофорезу с ДДС, еще один метод – изоэлектрофокусировка – разделяет белки только по их изоэлектрическим точкам. Принцип метода состоит в том, что в гель добавляют особые вещества – амфолиты. Это небольшие амфотерные молекулы с мол. массой несколько сотен дальтон. У них есть ценное для биохимиков свойство: под действием электрического поля эти вещества создают градиент рН – около катода среда будет щелочной, около анода – кислой, а по ходу геля рН будет плавно меняться.

Допустим, молекула определенного белка оказалась в зоне с рН выше его изоэлектрической точки. Она приобретет отрицательный заряд и будет двигаться к аноду. В процессе движения она будет попадать в области со все более низким рН и наконец дойдет до участка, где рН равен изоэлектрической точке. Там молекула белка остановится, поскольку ее суммарный заряд будет равен нулю. Пусть другая молекула оказалась в зоне с рН ниже изолектрической точки. У нее будет положительный заряд, она станет двигаться к катоду и тоже дойдет до зоны с рН, равным изоэлектрической точке. В итоге все молекулы данного белка сконцентрируются в очень узкой области, соответствующей его изоэлектрической точке. Другой белок будет сосредотачиваться в другой зоне, третий – в третьей и т. д.

Для проведения изоэлектрофокусировки используют самые крупнопористые гели, чтобы трение о пространственную решетку не замедляло движение белков. Если хотят разрушить четвертичную структуру белков и разделить их на субъединицы, то в гель добавляют мочевину.

Изоэлектрофокусировка разделяет белки по изоэлектрическим точкам, а электрофорез в додецилсульфате натрия – по молекулярной массе. Самое лучшее разделение получается при сочетании этих методов – двумерном электрофорезе. Белковую смесь сперва подвергают изоэлектрофокусировке. Затем полоску геля вымачивают в растворе додецилсульфата натрия, накладывают на пластину полиакриламидного геля с ДДС и проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном направлению изоэлектрофокусировки. В результате белки будут находиться в виде маленьких пятнышек на пластинке геля – получится как бы двумерная карта всех белков данной смеси. При этом «долгота» белкового пятнышка определяется его изоэлектрической точкой, а «широта» – его молекулярной массой.

Двумерный электрофорез позволяет провести разделение всех белков, содержащихся в живой клетке. В последнее время бурно развивается протеомика – область биохимии, изучающая весь спектр белков в каждом типе тканей, а также изменения этого спектра в норме (например, при увеличении функциональной нагрузки) и при патологии (например, при опухолевой трансформации). Протеомика позволит глубже понять причины различных патологических состояний организма и разработать новые способы их лечения. Метод двумерного электрофореза играет важнейшую роль в исследованиях, посвященных протеомике.

К настоящему времени полностью расшифрована последовательность нуклеотидов во всей ДНК человека, определено число генов, кодирующих белки (см. урок 7). Однако непосредственные фенотипические проявления организма определяют белки, а не нуклеиновые кислоты (в подавляющем большинстве случаев). Число же разных форм белков значительно превышает число генов – мы уже говорили, что один и тот же белок может по-разному фосфорилироваться, по-разному укладываться, по-разному разрезаться (см. уроки 5 и 6). По некоторым подсчетам общее число белковых форм может достигать нескольких сотен тысяч. Так что задачи, стоящие перед протеомикой, поистине грандиозны, однако и перспективы развития этого научного направления весьма заманчивы: энтузиасты протеомики полагают, что полная информация о белковом спектре клетки даст возможность познать все сферы ее жизнедеятельности и научиться управлять ими. Правда, скептики считают, для этого понадобятся еще и новые великие теории, ибо груда кирпичей сама по себе не складывается в красивое здание. Кто из них прав, покажет время.

Читайте также: