Денатурация белков. Ренатурация белков.

Обновлено: 25.04.2024

Ученые из Университета ИТМО в Санкт-Петербурге и Еврейского университета в Иерусалиме нашли способ восстановить структуру белка после химической денатурации. В основе метода лежит электростатическое взаимодействие свернувшихся, или денатурированных, белков с наночастицами оксида алюминия в воде. Авторы отмечают универсальность метода: он работает как для молекул одного вещества, так и в мультибелковых системах – ранее восстанавливать структуру белков в смесях никому не удавалось. В теории это поможет упростить и удешевить производство лекарственных белков, применяемых для лечения болезней Альцгеймера и Паркинсона. Результаты исследования опубликованы в журнале Scientific Reports.

Cхематичный белок, окруженный наночастицами

Белки, в особенности относящиеся к ним ускорители химических реакций – ферменты, являются основой фармацевтической и пищевой индустрии. Однако 80% этих веществ теряется еще в процессе синтеза. Под влиянием неблагоприятных факторов, например, при добавлении сильных кислот или щелочей, белки денатурируют, то есть теряют свою форму, а вместе с ней и химическую активность. Поэтому промышленность издавна искала универсальный способ, который позволил бы восстанавливать структуру белков и значительно удешевил бы их производство. При этом, для изготовления лекарств и пищевых продуктов на основе белков в промышленных масштабах важна возможность восстанавливать именно смеси, поскольку ренатурировать каждый тип белков по отдельности долго, дорого и неэффективно.

Российские химики совместно с иностранными коллегами предложили решение этой задачи. Ученые разработали метод, с помощью которого дали белкам вторую жизнь, вернув их молекулам исходную форму после денатурации. Этот процесс называют ренатурацией.

В новой работе исследователи развернули молекулы трех ферментов: карбоангидразы, фосфатазы и пероксидазы. Для этого денатурированные сильной щелочью белки смешали в воде с наночастицами оксигидроксида алюминия. Благодаря возникшему электростатическому взаимодействию, ферменты притянули к своей поверхности наночастицы и образовали с ними надмолекулярный комплекс, связанный не химически, а физически.

Защитная оболочка из наночастиц помешала молекулам белков слипаться, или агрегироваться, что позволило ученым достаточно легко извлечь ферменты из неблагоприятной среды. После промывки от остатков денатурирующих веществ ферменты самостоятельно восстановили свою структуру.

«Постоянное воздействие денатурирующих агентов и склонность свернувшихся макромолекул к агрегации являются одними из главных препятствий для восстановления белков. Удалив эти факторы, мы смогли регенерировать наши объекты», – рассказывает Катерина Володина, магистрант второго года обучения международной лаборатории “Растворная химия передовых материалов и технологий” Университета ИТМО.

Изменяя уровень pH среды, ученым удалось отделить наночастицы от белковых молекул. Это позволило неоднократно использовать вещества, участвующие в эксперименте.

Новый способ применили и для смеси из двух ферментов: карбоангидразы и фосфотазы (САВ и АсР). Для этих белков доля ренатурированных молекул превысила половину, что является беспрецедентным результатом.

«Ренатурация мультиферментных смесей – процесс уникальный, никто до нас этого не делал. Но мы с коллегами считаем, что работа в этом направлении интересна фармацевтическим кампаниям. Теоретически наш метод способен упростить и удешевить производство лекарств для лечения болезней Альцгеймера или Паркинсона. Многие из этих медикаментов изготовляются на основе белков», – отмечает Катерина Володина.

Помимо универсальности и высокой эффективности, способ, предложенный химиками из Университета ИТМО, отличается низкой стоимостью и быстродействием. Ученые собираются развивать свой подход к ренатурации белков именно на мультиферментных смесях.

Статья: Katerina V. Volodina, David Avnir and Vladimir V. Vinogradov (2017), Alumina nanoparticle-assisted enzyme refolding: A versatile methodology for proteins renaturation, Scientific Reports.

Денатурация белков: сущность процесса, изменение свойств белка, виды денатурации

Без категории

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температуры и рН среды.

Денатурация — это сложный процесс, при котором под влиянием внешних факторов (температуры, механического воздействия, действия кислот, щелочей, ультразвука и др.) происходит изменение вторичной, третичной и четвертичной структур белковой макромолекулы, т. е. нативной (естественной) пространственной структуры. Первичная структура, а, следовательно, и химический состав белка не меняются. При кулинарной обработке денатурацию белков чаще всего вызывает нагревание. Процесс этот в глобулярных и фибриллярных белках происходит по-разному.

Механизм денатурации

В глобулярных белках при нагревании усиливается тепловое движение полипептидных цепей внутри глобулы водородные связи, которые удерживали их в определенном положении, разрываются и полипептидная цепь разворачивается, а затем сворачивается по-новому. При этом полярные (заряженные) гидрофильные группы, расположенные на поверхности глобулы и обеспечивающие ее заряд и устойчивость, перемещаются внутрь глобулы, а на поверхность ее выходят реакционноспособные гидрофобные группы (дисульфидные, сульфгидрильные и др.), не способные удерживать воду.

Денатурация сопровождается изменениями важнейших свойств белка:

потерей индивидуальных свойств (например, изменение цвета мяса при его нагревании вследствие денатурации миоглобина);
потерей биологической активности (например, в картофеле, грибах, яблоках и ряде других растительных продуктов содержатся ферменты, вызывающие их потемнение, при денатурации белки-ферменты теряют активность);
повышением атакуемости пищеварительными ферментами (как правило, подвергнутые тепловой обработке продукты, содержащие белки, перевариваются полнее и легче);
потерей способности к гидратации (растворению, набуханию);
потерей устойчивости белковых глобул, которая сопровождается их агрегированием (свертыванием, или коагуляцией, белка).

Белки, представляющее собой более или менее обводненные гели (мышечные белки мяса, птицы, рыбы; белки круп, бобовых, муки после гидратации и др.), при денатурации уплотняются, при этом происходит их дегидратация с отделением жидкости в окружающую среду. Белковый гель, подвергнутый нагреванию, как правило, имеет меньшие объем, массу, большую механическую прочность и упругость по сравнению с исходным гелем нативных (натуральных) белков. Скорость агрегирования золей белка зависит от рН среды. Менее устойчивы белки вблизи изоэлектрической точки.

Агрегирование — это взаимодействие денатурированных молекул белка, которое сопровождается образованием более крупных частиц. Внешне это выражается по-разному в зависимости от концентрации и коллоидного состояния белков в растворе. Так, в малоконцентрированных растворах (до 1%) свернувшийся белок образует хлопья (пена на поверхности бульонов). В более концентрированных белковых растворах (например, белки яиц) при денатурации образуется сплошной гель, удерживающий всю воду, содержащуюся в коллоидной системе. Для улучшения качества блюд и кулинарных изделий широко используют направленное изменение реакции среды. Так, при мариновании мяса, птицы, рыбы перед жаркой; добавлении лимонной кислоты или белого сухого вина при припускании рыбы, цыплят; использовании томатного пюре при тушении мяса и др. создают кислую среду со значениями рН значительно ниже изоэлектрической точки белков продукта. Благодаря меньшей дегидратации белков изделия получаются более сочными.

Виды денатурации

Различают 2 вида денатурации:

Обратимая денатурация — ренатурация или ренактивация — это процесс, при котором денатурированный белок, после удаления денатурирующих веществ вновь самоорганизуется в исходную структуру с восстановлением биологической активности.

Необратимая денатурация — это процесс, при котором биологическая активность не восстанавливается после удаления денатурирующих агентов. Итак, денатурацию вызывают физические факторы: температура, давление, механические воздействия, ультразвуковые и ионизирующие излучения; химические факторы: кислоты, щелочи, органические растворители, алкалоиды, соли тяжелых металлов. Взбивание яичного белка, сливок превращает их в пену, состоящую из пузырьков воздуха, окруженных тонкими белковыми пленками, образование которых сопровождается развертыванием полипептидных цепей в результате разрыва связей при механическом воздействии. Таким образом, при образовании пленок происходит частичная или полная денатурация белка. Такой вид денатурации называется поверхностной денатурацией белка.

Для технологических процессов особое значение имеет тепловая денатурация белков. При длительной тепловой обработке белки подвергаются более глубоким изменениям, связанным с разрушением их макромолекул. На первом этапе изменений от белковых молекул могут отщепляться функциональные группы с образованием таких летучих соединений, как аммиак, сероводород, фосфористый водород, углекислый газ и др. Накапливаясь в продукте, они участвуют в образовании вкуса и аромата готовой продукции. При дальнейшей гидротермической обработке белки гидролизуются, при этом первичная (пептидная) связь разрывается с образованием растворимых азотистых веществ небелкового характера (например, переход коллагена в глютин). Деструкция белков может быть целенаправленным приемом кулинарной обработки, способствующим интенсификации технологического процесса.

Изменение структуры и свойств мяса

Денатурация мышечных белков мяса при тепловой обработке существенно влияет на свойства готовых изделий. Белки саркоплазмы при денатурации образуют сплошной гель, а белки миофибрилл, уже находящиеся в состоянии геля, уплотняются. Диаметр мышечных волокон при этом уменьшается на 36 — 42%, ткани уплотняются, сопротивление резанию в поперечном направлении возрастает. При варке ткани уплотняются больше, чем при жарке, так как в последнем случае температура в центре кусков ниже и время обработки сырья меньше. В молекуле миоглобина, придающего красную окраску сырому мясу, содержится хромофорная группа (обусловливающая окраску) — гем.

При денатурации входящий в нее ион двухвалентного железа окисляется. При этом из гема образуется гемин, обусловливающий серую окраску мяса. Изменение окраски говядины начинается при температуре 60°С, при температуре от 60 до 70°С красная окраска ослабевает и при дальнейшем повышении переходит в серо- коричневую. Миозин полностью денатурирует при температуре немногим выше 40°С, а 90% остальных белков мяса денатурируют при температуре 65°С. Однако для достижения кулинарной готовности необходимо мясо при жарке нагревать до температуры 80 — 85°С, а при варке — до температуры 95°С в течение некоторого времени. При этом денатурированные белки частично подвергаются более глубоким изменениям с образованием сероводорода, фосфористого водорода, меркаптанов и других летучих веществ. Часть аминокислот разрушается и вступает в реакцию меланоидинообразования. Поэтому слишком длительная тепловая обработка может снизить пищевую ценность мяса. Способы тепловой обработки и ее сроки определяются свойствами соединительной ткани. Кулинарная готовность наступает при превращении 20 — 45% коллагена в глютин. Сопротивление резанию при этом значительно снижается. Отсюда жарить лучше только те части мяса, в которых этот процесс успевает произойти раньше, чем изделие высохнет и начнет подгорать.

Значительно изменяется масса мясных полуфабрикатов при тепловой обработке. Потери массы составляют 35-40%. Вызвано это в основном тремя причинами: выделением влаги (30 — 35%), вытапливанием жира (около 5%) и потерями растворимых веществ в результате диффузии и выделения сока (в среднем 1—2% массы мяса). Выделение влаги при тепловой обработке мяса вызвано тем, что при денатурации белков уменьшается их способность удерживать воду, а сокращение волокон коллагена (сваривание) приводит к уменьшению геометрических размеров полуфабрикатов и выпрессовыванию из них выделяющейся влаги.

Ученые придумали способ «воскрешать» белки

Ученые из Университета ИТМО и Еврейского университета в Иерусалиме придумали способ восстанавливать структуру белков после температурной денатурации.

Метод способен не только восстанавливать активную функцию белков, но и повышать их изначальную активность практически в два раза. Ученые назвали данное явление эффектом феникса, проведя аналогию с известным мифическим созданием, которое, воскресая после смерти, становится еще сильнее. Результаты работы опубликованы в журнале Scientific Reports.

Белки — одни из важнейших молекул в клетке. Они могут выполнять свои функции, только если их структура не нарушена. При изменении структуры, например при нагревании, белок становится неактивным. Этот процесс называется денатурацией. Теоретически белкам можно вернуть активность, если восстановить их изначальную структуру — ренатурировать. Но на практике сделать это чрезвычайно сложно.

В своем исследовании ученые из Университета ИТМО и Еврейского Университета в Иерусалиме впервые показали, что возможно не только восстановить структуру ренатурированного белка, но еще и увеличить его активность по сравнению с нативной формой. Добиться такого результата удалось благодаря новому способу ренатурации белков, основанному на смешении денатурированных белковых молекул (карбоновая ангидраза) с коллоидным раствором неорганических наночастиц оксида алюминия.

При переходе коллоидного раствора в гель наночастицы начинают сшиваться друг с другом, оказывая на молекулы белка механическое давление. В результате каждая белковая молекула попадает в индивидуальную пористую оболочку из наночастиц, что препятствует спутыванию белков и возвращает им их исходную пространственную структуру.

Сравнив эффективность белков до денатурации и после ренатурации, ученые обнаружили, что «воскресшие» белки стали на 180% эффективнее, чем их нативные предшественники. Ученые объясняют этот эффект тем, что наночастицы как бы «выворачивают» активный центр белка так, что субстрат, с которым он взаимодействует, максимально легко может добраться до него.

Владимир Виноградов, заведующий лабораторией растворной химии передовых материалов и технологий Университета ИТМО. Фото: пресс-служба ИТМО

Как пояснил соавтор исследования Давид Авнир, открытие может быть также использовано для оптимизации производства лекарств на основе активных белков: «Большинство наиболее эффективных лекарств сегодня основаны именно на белках, которые получают из живых клеток. Однако среди выработанных таким образом белков лишь около 20% являются нативными и годны к использованию, в то время как остальные 80% составляют так называемые тела включения — тоже белки, но денатурированные. Очевидно, что возможность перевода денатурированных белков обратно в активное состояние, да еще и с повышенной эффективностью, позволило бы удешевить производство многих лекарств и сделать их более доступными».

За похожую работу — восстановление разрушенной при тепловой денатурации структуры белка куриного яйца - в 2015 году другому коллективу исследователей вручили Шнобелевскую премию.

Денатурация и ренатурация белков

Внешние факторы (изменение температуры, солевого состава среды, рН, радиация) могут вызывать нарушение структурной организации молекулы белка. Процесс утраты трехмерной конформации, присущей данной молекуле белка, называют денатурацией(рис. 260). Причиной денатурации является разрыв связей, стабилизирующих определенную структуру белка. Причем первоначально рвутся наиболее слабые связи, а при ужесточении условий и более сильные. Поэтому сначала утрачивается четвертичная, затем третичная и вторичная структуры. Вместе с тем, денатурация не сопровождается разрушением полипептидной цепи. Изменение пространственной конфигурации приводит к изменению свойств белка и, как следствие, делает невозможным выполнение белком свойственных ему биологических функций.

Рис. 260. Денатурация и ренатурация белка:

1 — молекула белка третичной структуры; 2 — денатурированный белок; 3 — восстановление третичной структуры в процессе ренатурации.

Денатурация может быть:

Обратимой, если возможно восстановление свойственной белку структуры. Такой денатурации подвергаются, например, рецепторные белки мембраны.

Необратимой, если восстановление пространственной конфигурации белка невозможно. Обычно это происходит при разрыве большого количества связей, например, при варке яиц.

Если белок подвергся обратимой денатурации, то при восстановлении нормальных условий среды он способен полностью восстановить свою структуру и, соответственно, свои свойства и функции. Процесс восстановления структуры белка после денатурации называется ренатурацией.

Функции белков

Благодаря сложности, разнообразию форм и состава, белки играют важную роль в жизнедеятельности клетки и организма в целом. Функции их разнообразны.

Строительная (структурная) функция

Одна из важнейших — строительная. Белки участвуют в образовании клеточных и внеклеточных структур: входят в состав клеточных мембран, шерсти, волос, сухожилий, стенок сосудов и т.д.

Транспортная функция

Некоторые белки способны присоединять различные вещества и переносить их к различным тканям и органам тела, из одного места клетки в другое. Например, белок крови гемоглобин присоединяет кислород и транспортирует его от легких ко всем тканям и органам, а от них в легкие переносит углекислый газ; в состав клеточных мембран входят особые белки, обеспечивают активный и строго избирательный перенос некоторых веществ и ионов из клетки во внешнюю среду и обратно.

Регуляторная функция

Большая группа белков организма принимает участие в регуляции процессов обмена веществ. Такими белками являются гормоны — биологически активные вещества, выделяющиеся в кровь железами внутренней секреции. Они влияют на активность ферментов, тем самым, замедляя или ускоряя обменные процессы, изменяют проницаемость клеточных мембран, поддерживают постоянство концентрации веществ в крови и клетках, участвуют в процессах роста, размножения и т.д. Например, гормон инсулин регулирует уровень сахара в крови путем повышения проницаемости клеточных мембран для глюкозы, способствует синтезу гликогена, увеличивает образование жиров из углеводов.

В ответ на проникновение в организм чужеродных белков или микроорганизмов (антигенов) образуются особые белки — антитела, способные связывать и обезвреживать их. Синтез этих белков, называемых иммуноглобулинами, происходит в лимфоцитах. Причем, практически на любой антиген, с которым клетка и организм никогда не встречались, лимфоциты способны синтезировать антитела. Фибрин, образующийся из фибриногена, способствует остановке кровотечений.

Особые сократительные белки участвуют во всех видах движения клетки и организма: образовании псевдоподий, мерцании ресничек и биении жгутиков у простейших, сокращении мышц у многоклеточных животных, движении листьев у растений и др.

Весьма важна для жизни клетки сигнальная функция белков. В поверхностную мембрану клетки встроены молекулы белков, способных изменять свою третичную структуру в ответ на действие факторов внешней среды. Так происходит прием сигналов из внешней среды и передача команд в клетку.

Благодаря белкам в организме могут откладываться про запас некоторые вещества. Например, при распаде гемоглобина железо не выводится из организма, а сохраняется в селезенке, образуя комплекс с белком ферритином. К запасным белкам относятся белки яйца, белки молока.

Белки являются одним из источников энергии в клетке. При распаде 1 г белка до конечных продуктов выделяется 17,6 кДж. Сначала белки распадаются до аминокислот, а затем до конечных продуктов — воды, углекислого газа и аммиака. Однако в качестве источника энергии белки используются тогда, когда другие (углеводы и жиры) израсходованы.

Одна из важнейших функций белков. В состав клеток входит большое количество веществ, химически мало активных. Тем не менее, все биохимические реакции протекают с огромной скоростью, благодаря участию в них биокатализаторов— ферментов — веществ белковой природы.

Общая характеристика ферментов

Как отмечалось ранее, большинство химических реакций в организме протекает с участием катализаторов — ферментов. Ферменты 7 — специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов.

Сходство ферментов и неорганических катализаторов заключается в том, что они:

снижают энергию активации 8 ;

не изменяют направления реакции, а лишь изменяют скорость ее протекания;

в катализируемой реакции всегда затрачивается меньше энергии, чем в некатализируемой.

Но, поскольку ферменты являются белками, это придает им особые свойства:

если неорганический катализатор может использоваться в разных типах реакций, то ферменты катализируют только одну реакцию или один вид реакции;

большинство неорганических катализаторов ускоряют химические реакции при очень высоких температурах, имеют максимальную эффективность в сильнокислой или сильнощелочной среде, при высоких давлениях, а большинство ферментов активны при температурах 35-45˚С, физиологических значениях кислотности раствора и при нормальном атмосферном давлении;

скорость ферментативных реакций в десятки тысяч (а иногда и в миллионы раз) выше скорости реакций, идущих с участием неорганических катализаторов. Например, пероксид водорода без катализаторов разлагается медленно: 2Н₂0₂ →2Н₂0 + 0₂. В присутствии солей железа (катализатора) эта реакция идет несколько быстрее. Ферменткаталазаза1сек. расщепляет 100 тыс. молекул Н₂0₂.

Известно более 2000 различных ферментов, представленных белками с высокой молекулярной массой, например каталаза (М=252000).

Химики из Университета ИТМО «воскресили» белки с помощью заряженных наночастиц

Химики из санкт-петербургского Университета ИТМО и Еврейского университета в Иерусалиме разработали новый метод «воскрешения» белков. В отличие от большинства способов, которые специфичны для восстановления активности отдельных белков, новый метод подходит для целой группы. Работа опубликована в Scientific Reports.

Белки представляют собой биополимеры, состоящие из цепочек аминокислот. Чтобы стать «работоспособной» и выполнять свои функции (например, катализировать клеточные процессы), молекула белка сворачивается в трехмерную структуру, которая стабилизируется взаимодействиями между разными аминокислотами белковой цепочки и молекулами в ее окружении. Большинство взаимодействий довольно слабые и их можно разрушить нагреванием, химическими реагентами (концентрированными кислотами или щелочами) или радиацией. В этом случае происходит денатурация белка, то есть его пространственная структура полностью или частично разрушается, молекулы белка слипаются между собой и белок теряет активность. В некоторых случаях, если из раствора убрать денатурирующие белок вещества или понизить его температуру, происходит обратный процесс — ренатурация, во время которого пространственная структура белка и его «работоспособность» частично восстанавливаются.

Многие лекарства, например антитела — это белки, и могут денатурировать. Поэтому исследователи активно ищут способы их «воскрешения». Методы восстановления можно разделить на группы: денатурирующие вещества убирают из раствора, так что белки частично восстанавливают свою активность; во время восстановления белков в раствор добавляют вещества, помогающие процессу, или регулируют физические условия во время ренатурации. Однако в большинстве таких методов приходится подбирать условия восстановления для каждого белка в отдельности: это трудоемкий и требующий времени процесс. Авторы новой работы разработали способ ренатурации, который подходит для целой группы отрицательно заряженных белков.

Ранее та же группа исследователей разработала метод «воскрешения» белков после температурной денатурации с помощью наночастиц оксида алюминия. К денатурированному белку карбоангидразе добавляли раствор наночастиц и высушивали смесь в вакууме. В результате образовывался гель, в структуре которого было достаточно места для восстановления трехмерной структуры карбоангидразы, так что активность белка восстанавливалась.

В новом исследовании ученые решили использовать наночастицы оксида алюминия более универсальным способом и попробовать «воскресить» отрицательно заряженные белки с помощью положительно заряженных наночастиц. В экспериментах использовались карбоангидраза, кислая фосфатаза и пероксидаза хрена. После химической денатурации исследователи добавляли в раствор одного, двух или трех белков положительно заряженные наночастицы оксида алюминия, на которых сорбировался белок. Таким образом частицы изолировали молекулы белка друг от друга и препятствовали их слипанию. Затем наночастицы с белками переносили в другой раствор, убирая денатурирующий агент, чтобы началось восстановление пространственной структуры белков. Процесс ренатурации происходил на поверхности наночастиц, которые за счет сильного заряда отталкивались друг от друга и не давали белкам слипаться. На последнем этапе из раствора «воскрешенных» белков удаляли наночастицы.

Оказалось, что новый метод позволил восстановить пространственную структуру у 60-70 процентов белков, если они ренатурировали поодиночке (из-за особенностей структуры пероксидазы она хуже поддается восстановлению, поэтому она ренатурировала меньше — примерно на 30 процентов). При смешивании в растворе двух белков процент восстановленных молекул достигал 70-80 процентов, а в смеси трех — 50-60 процентов. По мнению авторов работы, новый метод хорош тем, что наночастицы просты в получении и их можно использовать многократно, с их помощью можно «воскрешать» несколько белков одновременно.

Ранее ученые обнаружили, что многие белки клетки могут возвращаться к нормальной работе после резкого повышения температуры клетки. Оказалось, что «слипание» белков необязательно приводит к их последующей деградации, а скорее выполняет защитную и регуляторную функции.

Читайте также: