Хитин. Строение хитина. Муреин. Липиды.

Обновлено: 23.07.2024

Хитин ( C 8 H 13 N O 5)n (фр. chitine , от др.-греч. χιτών : хитон — одежда, кожа, оболочка) — природное соединение из группы азотсодержащих полисахаридов. Химическое название: поли-N-ацетил-D-глюкозо-2-амин, полимер из остатков N-ацетилглюкозамина, связанных между собой β-(1→4)-гликозидными связями.

Основной компонент экзоскелета (кутикулы) членистоногих и ряда других беспозвоночных, входит в состав клеточной стенки грибов.

Содержание

В 1821 году француз Анри Браконно, директор ботанического сада в Нанси, обнаружил в грибах вещество, нерастворимое в серной кислоте. Он назвал его фунгин [1] . Чистый хитин впервые выделен из внешних оболочек тарантулов. Термин был предложен французским учёным А. Одье, исследовавшим наружный покров насекомых, в 1823 году.

Структура хитина была открыта в 1929 году Альбертом Хофманном [2] .

Хитин — один из наиболее распространённых в природе полисахаридов — каждый год на Земле в живых организмах образуется и разлагается около 10 миллиардов тонн хитина.

  • Выполняет защитную и опорную функции, обеспечивая жёсткость клеток — содержится в клеточных стенкахгрибов.
  • Главный компонент экзоскелетачленистоногих.
  • Также хитин образуется в организмах многих других животных — разнообразных червей, кишечнополостных и т. д.

Во всех организмах, вырабатывающих и использующих хитин, он находится не в чистом виде, а в комплексе с другими полисахаридами, и очень часто ассоциирован с белками. Несмотря на то, что хитин является веществом, очень близким по строению, физико-химическим свойствам и биологической роли к целлюлозе, в организмах, образующих целлюлозу (растения, некоторые бактерии) хитин найти не удалось.

Представляет собой твёрдое бесцветное либо полупрозрачное вещество (жёсткое на ощупь), не растворимое в воде и полярных органических растворителях (этаноле, диэтиловом эфире, ацетоне), растворяется в растворе хлорида лития в диметилацетамиде (при отсутствии следов воды), в концентрированных растворах некоторых солей (хлорид цинка, тиоцианат лития, соли кальция) и в ионных жидкостях.

В естественном виде хитины разных организмов несколько отличаются друг от друга по составу и свойствам. Молекулярная масса хитина достигает 260 000.

При нагревании с концентрированными растворами минеральных кислот (соляной или серной) происходит гидролиз, в результате образуются мономеры N-Ацетилглюкозамина.

При длительном нагревании хитина с концентрированными растворами щелочей происходит N-деацетилирование и образуется хитозан.

Ферменты, расщепляющие β(1→4)-гликозидную связь в молекуле хитина, называются хитиназами.

Синтез молекулы хитина происходит в хитосомах, где с помощью одного фермента гликозилтрансферазы известной, как хитинсинтетаза (КФ 2.4.1.16) осуществляется перенос остатков N-ацетил-D-глюкозамина из уридиндифосфат-N-ацетил-D-глюкозамина (UDPGlcNAc) на растущую полимерную цепь.

Одно из производных хитина, получаемое из него промышленным способом — хитозан. Сырьём для его получения служат панцири ракообразных (криль, камчатский краб), а также продукты микробиологического синтеза. Проблемами производства продукции из хитина и его практического использования занимается Российское хитиновое общество [3] .

ХИТИН — (ново лат., от греч. chiton хитон). Вещество, содержащееся во внешних покровах членистых животных, а также вообще в роговых частях тела. Словарь иностранных слов, вошедших в состав русского языка. Чудинов А.Н., 1910. ХИТИН главная составная часть … Словарь иностранных слов русского языка

ХИТИН — ХИТИН, твердое, жесткое вещество, широко распространенное в природе; в частности, из него сделаны твердые панцири (ЭКЗОСКЕЛЕТЫ) ЧЛЕНИСТОНОГИХ, таких как крабы, насекомые, пауки и родственные им виды. Стенки ГИФ микроскопических трубочек грибов… … Научно-технический энциклопедический словарь

ХИТИН — полисахарид, образованный остатками аминосахара ацетилглюкозамина. Основной компонент наружного скелета (кутикулы) насекомых, ракообразных и других членистоногих. У грибов заменяет целлюлозу, с которой сходен по химическим и физическим свойствам… … Большой Энциклопедический словарь

ХИТИН — ХИТИН, хитина, муж. (от греч. chiton хитон) (зоол.). Вещество, из которого состоит твердый наружный покров членистоногих животных (насекомых, раков и т.д.). Толковый словарь Ушакова. Д.Н. Ушаков. 1935 1940 … Толковый словарь Ушакова

Хитин — ЦИГЕЛЬНИКОВ Отчество от именования отца по его профессии: цигельник рабочий кирпичного завода (из нем. Ziegel кирпич). (Н). (Источник: «Словарь русских фамилий». («Ономастикон»)) … Русские фамилии

хитин — опорный полисахарид беспозвоночных (наружный скелет членистоногих) и компонент клеточной стенки грибов и некоторых зеленых водорослей. Линейный полимер из остатков N–ацетил–О–глюкозамина в клеточной стенке, образует (подобно целлюлозе, муреину)… … Словарь микробиологии

хитин — сущ., кол во синонимов: 1 • полисахарид (36) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

ХИТИН — [χιτών (υитон) одежда, оболочка, скорлупа] единственный известный в природе азотсодер. полисахарид (см. Углеводы), аналог клетчатки. X. входит в состав наружных покровов многих беспозвоночных членистоногих, моллюсков … Геологическая энциклопедия

Хитин — Структурная формула молекулы хитина Хитин (C8H13 … Википедия

Все знают о целлюлозе: по общему объему органической массы этот полисахарид занимает первое место на Земле. И все знают, насколько важен этот углевод для промышленности. А вот о полисахариде, который стоит на втором месте по своей массе и не менее полезен человеку, — хитине — помнят разве что любители биологии. Вещество является основным компонентом экзоскелета (панцирь и клешни) членистоногих и некоторых беспозвоночных, а также входит в состав клеточной стенки грибов и бактерий. О невероятных свойствах хитина и их применении в медицине, пищевой промышленности и радиационной защите говорили на совместной научной сессии Российского хитинового общества и кафедры технологии мясных, рыбных продуктов и консервирования холодом Университета ИТМО.


В природе хитин выполняет защитную и опорную функции, обеспечивая прочность ракообразных, грибов и бактерий. В этом он похож на целлюлозу, которая является опорным материалом клеточной стенки растений. Но хитин является более реакционноспособным, говорится в материалах Российского хитинового общества. При нагревании и обработке концентрированной щелочью он превращается в хитозан. Этот полимер может растворяться в растворах разбавленных кислот, а также связываться и реагировать с другими химическими веществами. Таким образом, иногда химики называют хитозан «конструктором», с помощью которого можно создавать различные полимеры. Чтобы получить хитин в чистом виде, из содержащих его органических веществ удаляют белок, кальций и другие минералы, переводя их в растворимую форму. В результате получается хитиновая крошка.

«Для получения хитина используются ракообразные, грибы и насекомые. К слову, это вещество было впервые обнаружено в шампиньонах. Применение хитина и производного от него хитозана только расширяется. Полисахарид входит в состав пищевых добавок, лекарств, противоожоговых препаратов, растворимых хирургических нитей, используется в противорадиационных целях и во многих других. Хитозан — это полезная вещь, которая требует дальнейшего изучения», — прокомментировал президент Российского хитинового общества, доктор химических наук Валерий Варламов

Хитин в медицине

Благодаря тому, что хитозан отлично реагирует с другими химическими веществами, на цепочку полимера можно «навешивать», например, лекарства и рецепторы. Таким образом, действующее вещество будет высвобождаться только там, где оно нужно, не подвергая токсикозу весь организм. Более того, хитозан сам по себе совершенно не токсичен для живых существ, подчеркнул профессор Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности Алексей Албулов.


Университет ИТМО. Алексей Албулов

Хитозан также используется в качестве БАДа. Например, его низкомолекулярная фракция непосредственно всасывается в кровь и работает на уровне иммунной системы. Среднемолекулярная фракция является антибактериальным компонентом, который подавляет развитие патогенной микрофлоры в кишечнике. Кроме того, она способствует образованию пленки на слизистых оболочках кишечника, которая защищает их от воспаления. При этом пленка быстро растворяется, что важно для применения в медицине. Высокомолекулярная фракция хитозана служит в качестве сорбента для токсинов, которые есть в желудочно-кишечном тракте.

«Мы знаем много сорбентов, которые также обладают вредными для человека свойствами — они всасываются, откладываются в мышцах и костях. Хитозан лишен всех этих побочных эффектов. Более того, он может сорбировать экстракты трав, которые в связке с ним долго не теряют своих полезных свойств, и использоваться в качестве БАДа. Также хитозан используется в гелевой форме для лечения заболеваний полости рта или ожогов», — добавил Алексей Албулов.

Кроме того, хитозан обладает противоопухолевым эффектом, поэтому может применяться для профилактики рака, подчеркнула ученый секретарь Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН Ирина Мысякина. Вещество снижает уровень холестерина, так как связывает пищевые липиды и препятствует всасыванию жиров из кишечника. Также ведутся исследования применения хитозана в качестве медицинских имплантов.


Университет ИТМО. Научная сессия Российского хитинового общества

Хитин и генная терапия

Генная терапия сейчас активно развивается. С помощью научного метода можно устранить активность того или иного «вредного» гена или вставить вместо него другой. Но для того, чтобы это сделать, необходимо каким-то образом доставлять «нужную» генную информацию в клетку. Раньше для этого использовались вирусы, однако у этой системы есть множество недостатков: канцерогенность и дороговизна в первую очередь подчеркнул сотрудник Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Андрей Критченков. Но с помощью хитозана можно доставлять необходимую генную информацию в клетку без вредных последствий и относительно дешево.

«Невирусные векторы для доставки РНК можно буквально музыкально настраивать с помощью химических модификаций. Хитозан — более эффективный вектор, чем липосомы или катионные полимеры, потому что он лучше связывается с ДНК. Кроме того, такие системы нетоксичны, и их можно получать при комнатной температуре», — рассказал ученый.

Хитин в пищевой промышленности

Способность хитозана к абсорбированию используется в пивоварении для удаления осадка. Так называемые помутнения в напитке образуются из-за компонентов сырья и вспомогательных материалов в виде белков, углеводов, живых клеток и оксалатов. Чтобы удалять живые клетки, на этапе осветления продукта используется хитозан, привела пример профессор кафедры пищевой биотехнологии продуктов из растительного сырья Университета ИТМО Татьяна Меледина.

Об использовании хитозана для сохранения свежести сырого мяса рассказал доцент кафедры Денис Бараненко. Для этого пленка из хитозана в составе с другими веществами (крахмал, клетчатка или желатин) была нанесена на продукт, чтобы предотвратить потерю влаги. Дело в том, что понижение активности воды на поверхности продукта увеличивает время его хранения. Кроме того, хитозановая пленка понижает скорость распространения микробов в сыром мясе, подавляет появление бактерии золотистого стафилококка.


Университет ИТМО. Денис Бараненко

«Обычно свежее мясо хранится не более двух дней. В результате экспериментов с хитозаном нам удалось повысить продолжительность хранения в полтора-два раза. В некоторых случаях срок доходил и до двух недель. Кроме того, с точки зрения потребительских свойств, пленка из хитозана — идеальная упаковка, так как ее практически не видно», — сказал Денис Бараненко.

Хитозан в пищевой индустрии также применяется для свертывания сывороточных белков в молочной промышленности, для производства йодированных продуктов питания на основе создания комплексов «йод-хитозан» и для других целей.

На научной сессии также были представлены возможности Университета ИТМО по разработкам и исследованиям в области применения хитозана.

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства

Хитин (поли N-ацетил- D-глюкозамин) - азотосодержащий линейный полисахарид, по химическому строению и структурным характеристикам сходен с целлюлозой, занимает второе место после нее по распространенности в природе (рис.1).

(10,J кг) хитина. Рис.1 Структура хитина

Хитин встречается в наружном покрове членистоногих (ракообразные, насекомые), скелете морского зоопланктона, клеточной стенке грибов дрожжей, трубках погонофор [1]. Хитин присутствует в стенках цисты инфузории, клетках зеленых водорослей, иглах диатомовых, стеблях золотистых и волокнах гаптофитовых водорослей [2]. Хитин отсутствует у прокариотных организмов и у растений, хотя в состав клеточной стенки бактерий входит муреин, содержащий N-ацетил-D-глюкозамин. В живых организмах хитин образует микрофибриллярный порядок, что обеспечивает линейную конформацию молекул, закрепленную водородными связями. Эти фибриллы диаметром от 2,5 до 2,8 нм обычно входят в белковую матрицу [3].

Хитин присутствует в трех полимерных модификациях с различной ориентацией хитиновых микрофибрилл: а, |3, у. В природе получила распространение форма а-хитина, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Она присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов [1]. В р-форме цепочки располагаются параллельно относительно друг друга и направлены в одну сторону. В (3-форме цепочки обладают более

высокой растворимостью и набуханием за счет более слабых молекулярных водородных связей [4]. Эта форма встречается у каракатицы, в гладиусе кальмара, трубках погонофор, у-форма имеет смешанную систему параллельных и антипараллельных цепочек и присутствует в коконах насекомых [5].

Р- и у-формы хитина под действием концентрированных кислот (муравьиной, азотной и соляной) могут переходить в а- форму, являющейся наиболее стабильной.

Хитин нерастворим в воде, разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и других органических растворителях. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солях при нагревании. Хитин способен образовывать комплексы с органическими веществами (холестерин, белки, пептиды), обладает высокой сорбционной способностью к тяжелым металлам, радионуклидам. Хитин не разлагается под действием ферментов млекопитающих, но разлагается некоторыми ферментами насекомых, грибов и бактерий, отвечающих за распад хитина в природе [6,7]. Среди разнообразных производных этого полимера наиболее доступным является хитозан, получаемый в процессе деацетилирования хитина.

Хитозан (поли - D-глюкозамин) в отличие от хитина не встречается

в живых организмах, за исключением сн2ин пщ

некоторых видов грибов (рис. 2). Рис. 2 Структура хитозана

Важной характеристикой полимера является степень ацетилирования: отношение остатков N-ацетил- D-глюкозамина к общему количеству мономерных звеньев в полимере. Общепринято считать, что хитозан - это полимер со степенью ацетилирования ниже 50%. В присутствии кислот свободные аминогруппы хитозана акцептируют протоны, приобретая положительный заряд, и хитозан образует водорастворимые соли аналогично другим аминам. При этом в первую очередь от степени протонирования его свободных аминогрупп зависит растворимость

хитозанового полимера. В среднем, хитозан хорошо растворяется, когда протонированы, по крайней мере, половина его свободных аминогрупп, то есть когда рН раствора соответствует значению рК полимера. Для образцов хитозана с молекулярной массой 10-100 кДа и степенью деацетилирования 80-90% величина рК лежит в районе 6,2-6,5 [8].

С увеличением молекулярной массы и степени ацетилирования хитозана значение рК снижается. Таким образом, для растворения высокомолекулярных образцов с высокой степенью ацетилирования требуются более кислые условия, а снижение молекулярной массы и увеличение степени деацетилирования полимера позволяет им растворяться при нейтральном значении рН. При значениях рН gt; 7 хитозан теряет положительный заряд и выпадает в осадок, за исключением олигомеров со степенью полимеризации до 10.

За счет положительного заряда хитозан имеет большое сродство к сорбции таких молекул, как белки, пестициды, красители, липиды,

Хитин — «нераскрученная звезда» полисахаридов

Все знают о целлюлозе: по общему объему органической массы этот полисахарид занимает первое место на Земле. И все знают, насколько важен этот углевод для промышленности. А вот о полисахариде, который стоит на втором месте по своей массе и не менее полезен человеку, — хитине — помнят разве что любители биологии. Вещество является основным компонентом экзоскелета (панцирь и клешни) членистоногих и некоторых беспозвоночных, а также входит в состав клеточной стенки грибов и бактерий. О невероятных свойствах хитина и их применении в медицине, пищевой промышленности и радиационной защите говорили на совместной научной сессии Российского хитинового общества и кафедры технологии мясных, рыбных продуктов и консервирования холодом Университета ИТМО.


В природе хитин выполняет защитную и опорную функции, обеспечивая прочность ракообразных, грибов и бактерий. В этом он похож на целлюлозу, которая является опорным материалом клеточной стенки растений. Но хитин является более реакционноспособным, говорится в материалах Российского хитинового общества. При нагревании и обработке концентрированной щелочью он превращается в хитозан. Этот полимер может растворяться в растворах разбавленных кислот, а также связываться и реагировать с другими химическими веществами. Таким образом, иногда химики называют хитозан «конструктором», с помощью которого можно создавать различные полимеры. Чтобы получить хитин в чистом виде, из содержащих его органических веществ удаляют белок, кальций и другие минералы, переводя их в растворимую форму. В результате получается хитиновая крошка.

«Для получения хитина используются ракообразные, грибы и насекомые. К слову, это вещество было впервые обнаружено в шампиньонах. Применение хитина и производного от него хитозана только расширяется. Полисахарид входит в состав пищевых добавок, лекарств, противоожоговых препаратов, растворимых хирургических нитей, используется в противорадиационных целях и во многих других. Хитозан — это полезная вещь, которая требует дальнейшего изучения», — прокомментировал президент Российского хитинового общества, доктор химических наук Валерий Варламов

Хитин в медицине

Благодаря тому, что хитозан отлично реагирует с другими химическими веществами, на цепочку полимера можно «навешивать», например, лекарства и рецепторы. Таким образом, действующее вещество будет высвобождаться только там, где оно нужно, не подвергая токсикозу весь организм. Более того, хитозан сам по себе совершенно не токсичен для живых существ, подчеркнул профессор Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности Алексей Албулов.

Университет ИТМО. Алексей Албулов

Университет ИТМО. Алексей Албулов

Хитозан также используется в качестве БАДа. Например, его низкомолекулярная фракция непосредственно всасывается в кровь и работает на уровне иммунной системы. Среднемолекулярная фракция является антибактериальным компонентом, который подавляет развитие патогенной микрофлоры в кишечнике. Кроме того, она способствует образованию пленки на слизистых оболочках кишечника, которая защищает их от воспаления. При этом пленка быстро растворяется, что важно для применения в медицине. Высокомолекулярная фракция хитозана служит в качестве сорбента для токсинов, которые есть в желудочно-кишечном тракте.

«Мы знаем много сорбентов, которые также обладают вредными для человека свойствами — они всасываются, откладываются в мышцах и костях. Хитозан лишен всех этих побочных эффектов. Более того, он может сорбировать экстракты трав, которые в связке с ним долго не теряют своих полезных свойств, и использоваться в качестве БАДа. Также хитозан используется в гелевой форме для лечения заболеваний полости рта или ожогов», — добавил Алексей Албулов.

Кроме того, хитозан обладает противоопухолевым эффектом, поэтому может применяться для профилактики рака, подчеркнула ученый секретарь Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН Ирина Мысякина. Вещество снижает уровень холестерина, так как связывает пищевые липиды и препятствует всасыванию жиров из кишечника. Также ведутся исследования применения хитозана в качестве медицинских имплантов.

Университет ИТМО. Научная сессия Российского хитинового общества

Университет ИТМО. Научная сессия Российского хитинового общества

Хитин и генная терапия

Генная терапия сейчас активно развивается. С помощью научного метода можно устранить активность того или иного «вредного» гена или вставить вместо него другой. Но для того, чтобы это сделать, необходимо каким-то образом доставлять «нужную» генную информацию в клетку. Раньше для этого использовались вирусы, однако у этой системы есть множество недостатков: канцерогенность и дороговизна в первую очередь подчеркнул сотрудник Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Андрей Критченков. Но с помощью хитозана можно доставлять необходимую генную информацию в клетку без вредных последствий и относительно дешево.

«Невирусные векторы для доставки РНК можно буквально музыкально настраивать с помощью химических модификаций. Хитозан — более эффективный вектор, чем липосомы или катионные полимеры, потому что он лучше связывается с ДНК. Кроме того, такие системы нетоксичны, и их можно получать при комнатной температуре», — рассказал ученый.

Хитин в пищевой промышленности

Способность хитозана к абсорбированию используется в пивоварении для удаления осадка. Так называемые помутнения в напитке образуются из-за компонентов сырья и вспомогательных материалов в виде белков, углеводов, живых клеток и оксалатов. Чтобы удалять живые клетки, на этапе осветления продукта используется хитозан, привела пример профессор кафедры пищевой биотехнологии продуктов из растительного сырья Университета ИТМО Татьяна Меледина.

Об использовании хитозана для сохранения свежести сырого мяса рассказал доцент кафедры Денис Бараненко. Для этого пленка из хитозана в составе с другими веществами (крахмал, клетчатка или желатин) была нанесена на продукт, чтобы предотвратить потерю влаги. Дело в том, что понижение активности воды на поверхности продукта увеличивает время его хранения. Кроме того, хитозановая пленка понижает скорость распространения микробов в сыром мясе, подавляет появление бактерии золотистого стафилококка.

Университет ИТМО. Денис Бараненко

Университет ИТМО. Денис Бараненко

«Обычно свежее мясо хранится не более двух дней. В результате экспериментов с хитозаном нам удалось повысить продолжительность хранения в полтора-два раза. В некоторых случаях срок доходил и до двух недель. Кроме того, с точки зрения потребительских свойств, пленка из хитозана — идеальная упаковка, так как ее практически не видно», — сказал Денис Бараненко.

Хитозан в пищевой индустрии также применяется для свертывания сывороточных белков в молочной промышленности, для производства йодированных продуктов питания на основе создания комплексов «йод-хитозан» и для других целей.

На научной сессии также были представлены возможности Университета ИТМО по разработкам и исследованиям в области применения хитозана.

Муреин. Состав и свойства муреина

Муреин представляет собой опорный биополимер клеточной стенки бактерий, также известный как пептидоглюкан. Муреин - это гетерополимер (Н-ацетилглюкозамина и Н-ацетилмурамовой кислоты, сшитых через лактатные остатки короткими цепочками пептида). Как определяющее вещество для одного из трех доменов живых существ, безусловно, данный полимер имеет свои особенности строения и функции. Попробуем разобрать их.

Муреин в клеточной стенке

Строение бактериальной клетки

Бактерии представляют собой обширный кластер прокариотических организмов. Их генетический аппарат не заключен в обособленное мембраной ядро. Тем не менее, несмотря на эволюционно раннее появление, эти организмы распространились по всем средам нашей планеты. Они могут обитать и в нефтяных месторождениях, в кипящей воде гейзеров, в холодных водах северных океанов, в кислотах желудка животных. Стойкость к негативным факторам окружающей среды достигается во многом за счет особого вещества, составляющего основу клеточной стенки бактерии. Вещество это – муреин.

Клетка бактерий состоит на 80-85 % из воды, из оставшихся 20 % как правило половину составляют белки, пятую часть РНК, 5 % ДНК и немного липидов. На клеточную стенку приходится 20 % сухого вещества (у некоторых видов микроорганизмов даже до 50 %). Толщина этой пластинки - около 0,01-0,045 микрометров.

Строение бактериальной клетки

Муреин в клеточной стенке

Наличие твердой стенки характерно не только для бактерий, но и для грибов и растений. Однако только у прокариотов она имеет подобный состав. Клеточная стенка бактерии представляет из себя прочный панцирь из сложной молекулы полисахарида муреина. Структура полипептида представляет из себя параллельно расположенные полисахаридные цепи, связанные между собой пептидными остатками. Модульная единица – дисахарид муропептид (в нем ацетил-Д соединен с ацетилмурамовой кислотой).

Основная черта, определяющая свойства мешка, образованного муреином, – наличие замкнутой сети цепей полисахарида. Это формирует плотную сеть без разрывов. Видоспецифичной является плотность этой стенки – у некоторых видов она менее плотная (кишечная палочка), у других – более (золотистый стафилококк).

В биологии муреин – это не просто полипептид, но и сопутствующие ему компоненты клеточной стенки бактерий. Например, у грамположительных бактерий в состав также включены полисахариды, тайхоевые кислоты, белки или другие полипептиды. Еще больше подобных включений у грамотрицательных бактерий. Для них характерны сложные липосахариды, липопротеины, полипептиды.

Роль данных веществ в защите от вирусов-бактериофагов, а также в защите от агрессивных антибиотиков и ферментов. У бактерий, относящихся к грамположительным, корпус хрупкий. У грамотрицательных бактерий в связи с наличием большого количества дополнительных включений, муреиновый скелет покрыт мягкой защитной оболочкой из липидов.

Виды пептидогликана

Хотя муреин - это компонент клеточной стенки, характерный только для бактерий, существуют также подобные ему структуры. Например, в стенке некоторых археев (безъядерные микроорганизмы, не имеющие структур-органелл) и глаукоцистофитовых водорослей образуется псевдопептидогликан. Выполняет он те же функции и по составу сходен с муреином.

Состав муреина, его строение

Структура представляет из себя ячеистую сеть, образованную компонентами n-ацетилглюкозамина и n-ацетилмурамовой кислоты. Связи образованы за счет β1,4-гликозидных связей. Сшивка производится посредством остатков пептидов на основе действия фермента транспептидазы. Такая цепь содержит Д-глутаминовую кислоту, Л-лизин, Д-аланин, Л-аланин.

При этом особенностью является то, что такие Д-структуры содержатся только в прокариотических клетках. Таким образом, образованный полипептид приобретает вид трехмерной структуры, составляющей основу клеточной стенки бактерий. Он обеспечивает прочность, устойчивость и стабильность мембране.

Состав муреина

Свойства и функции

Свойства муреина обусловлены его структурой. Помимо выполнения механической и опорной функции, он обладает антигенными свойствами. Это обуславливает его многогранную защитную роль для бактерии.

Одна из основных функций муреина - это транспорт веществ в бактерию и вывод их наружу. Этим свойством обуславливается участие пептидогликана в хемо- и фотосинтезе эукариот, фиксации азота и других важнейших процессах. Все они связаны с взаимодействием клетки и окружающей среды, что обеспечивается клеточной стенкой.

При этом не только крупные молекулы не могут миновать ячеистую сеть этого вещества. Муреин обладает избирательной проницаемостью по отношению, например, к антибиотическим агентам. Это свойство возникает в процессе эволюции и искусственного отбора со стороны человека.

Участие данной структуры в движении клетки связано с наличием ворсинок и жгутиков, имеющих мембранную структуру и плотно связанных с муреиновым мешком.

Состав пептидных цепочек, входящих в состав пептидогликана, является систематическим признаком и помогает различать таксоны этих микроорганизмов. Кроме того, согласно форме, которую придает муреин бактерии, мы различаем их группы - кокки (круглые), палочки, спирохеты и т. д.

Муреин в биологии

Количество и качество дополнительных включений в структуру клеточной стенки определяет два крупных кластера микроорганизмов: грамположительных и грамотрицательных бактерий. Разделение производится посредством детектирующего окрашивания.

Устойчивость муреина

Так как муреин входит в состав бактериальной клеточной стенки, он является сигнальным веществом для иммунной системы как человека, так и других организмов. Например, фермент лизоцим расщепляет бета 1,4-гликозидные связи между остатками ацетилглюкозамина и ацетилмурамовой кислоты, тем самым вызывая гидролизацию пептидоглюкана и гибель бактериальной клетки.

Лизоцим является одним из ферментов слюны млекопитающих, что обуславливает ее антибактериальные свойства. Также разрушает пептидные цепочки муроэндопептидаза, тем самым вызывая разрушение полимера. Создаваемые антибиотики (например, пенициллин, цефалоспорин) нарушают производство пептидогликана. Циклосерин нарушает синтез аланина.

Антибиотики и муреин

В ответ на это воздействие возникает ответная реакция бактерий на защиту от антибиотиков. Мутация в генетической последовательности, отвечающей за синтез лактамаз, транспептидазы приводят к возникновению штаммов, устойчивых к антибиотикам. Также эволюционный ответ прокариотов заключается в постепенном изменении проницаемости мембраны для циклосерина и других веществ.

Муреин в биологии - это постоянно изменяющаяся система. Этим объясняется постоянная гонка "антибиотики-новые штаммы бактерий", где получение новых активных препаратов неизбежно связано с постепенным уменьшением их активности.

Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств Зуева Ольга Юрьевна

Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств

Зуева Ольга Юрьевна. Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств : Дис. . канд. техн. наук : 03.00.23 : Щелково, 2004 152 c. РГБ ОД, 61:05-5/379

Содержание к диссертации

1. Обзор литературы 9

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства

1.2. Области применения 12

1.3. Основные источники хитина и хитозана 14

1.3.1. Ракообразные (Crustacea) 14

1.3.2. Грибы (Fungi) 17

1.3.3. Насекомые (Insecta) 19

1.3.4. Нетрадиционные источники 25

1.4. Способы переработки хитинсодержащего панциря ракообразных 26

1.4.1. Получение хитина с помощью химических и биотехнологических способов обработки 26

1.4.2. Получение хитозана с использованием химических и ферментативных методов 30

1.4.3. Способы гидролиза хитозана 35

1.5. Получение хитина и хитозана из насекомых 46

2. Экспериментальная часть '. 51

2.1. Объекты исследований, исходные материалы и химические реагенты 51

2.2. Методы исследования 52

2.2.1. Технологические стадии 52

2.2.2. Методы анализа 55

2.2.3. Изучение некоторых свойств полученных веществ 59

3. Результаты и их обсуждение 62

3.1. Разработка технологии получения биологически активных веществ из подмора пчел 62

3.1.1. Водная экстракция 63

3.1.2. Депротеинирование 67

3.1.3. Обесцвечивание 72

ЗЛА. Деацетилирование 80

3.1.5. Ферментативный гидролиз 86

3.2. Технология переработки подмора пчел 99

3.3. Физико-химические свойства полученных продуктов 103

3.4. Биологические свойства полученных продуктов 114

3.4.1. Антиоксидантные свойства 114

3.4.2. Генопротекторные свойства 122

3.4.3. Фотопротекторные свойства 127

Список литературы 134

Введение к работе

Полисахариды хитин и хитозан, а также их производные, считаются,
перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам,
^ предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005г.

составит около 2 млрд. долларов, из которых — 75% будет использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях, биотехнологии, сельском хозяйстве. Уникальная структура макромолекулы хитозана и наличие положительного заряда обусловливают проявление ряда полезных свойств (антиоксидантные, радиопротекторные, волокно- и пленкообразующие, иммуномодулирующие, противоопухолевые и др.), а также его низкую токсичность и способность к биодеградации.

Пигмент меланин представляет собой высокомолекулярный
биополимер нерегулярной структуры, относящийся к классу
конденсированных фенольных соединений, обусловливающих темную
* окраску покрова насекомых, волос человека, клеточной стенки грибов,

растений и микроорганизмов. Наличие разнообразных функциональных групп, высокостабильных парамагнитных центров, сопряженной системы двойных связей в молекуле меланина обеспечивают разнообразное применение в качестве фото-, радиопротекторов и антиоксидантов в различных областях промышленности.

На сегодняшний день основным источником для получения хитина и
хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль).
Технология обработки включает постадийное удаление сопутствующих
веществ с использованием химических и ферментативных способов
обработки. Основными субстратами для выделения меланинов являются
„' чернильная сумка каракатицы Sepia officinalis, микро- и макромицеты, грибы

и дрожжи, темные сорта винограда, проявляющие сходные биозащитные свойства с меланинами животного происхождения.

Расширение областей применения; данных биополимеров обусловливает поиск новых перспективных источников 1 хитина и меланина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Вместе с хитином и белком в кутикуле присутствуют эумеланины, ковалентно связанные с остальными компонентами, обусловливающие окраску насекомого и некоторые защитные свойства. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить подмор пчел - медоносные пчелы Apis melliferaL., погибшие во время зимовки в улье. Согласно расчетам, сырьевая база подмора пчел может составить от 6 до 10 тыс. тонн в год.

Цель настоящей работы - разработка биотехнологических процессов получения хитина, хитозана, меланина и их комплексов из подмора пчел, изучение некоторых физико-химических и биологических свойств данных полимеров.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи исследования:

разработать технологию переработки подмора пчел с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки;

согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить = комплексную переработку подмора пчел с получением интересующих биологически активных веществ;

изучить основные физико-химические свойства промежуточных и основных продуктов, полученных на каждой стадии переработки;

исследовать некоторые биологические свойства водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса.

Научная новизна работы

Обосновано использование кутикулы пчелиных для получения различных соединений. Разработана комплексная технологическая схема переработки пчелиного подмора с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Определены основные оптимальные параметры переработки пчелиного подмора на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента. При исследовании ферментативного гидролиза показано, что хитозан-меланиновый комплекс может гидролизоваться с использованием специфических и неспецифических ферментов. Показано, что, варьируя условиями ферментативного гидролиза, существует возможность получения; хитозан-меланинового комплекса с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования в зависимости от целей использования. Исследованы антиоксидантные, генопротекторные и фотопротекторные свойства хитозан-меланинового комплекса и меланинсодержащих продуктов из подмора пчел.

Впервые показана возможность использования кутикулы пчелы Apis mellifera L. для одновременного выделения меланиновых пигментов и комплекса хитозана с меланином с различной молекулярной массой* и степенью деацетилирования.

Практическая значимость работы

Разработана комплексная схема переработки подмора пчел с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии. Разработана рецептура косметического крема на основе водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозана для обеспечения фотозащитных свойств.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 25 рисунков, библиографию из 158 наименований.

ММ - молекулярная масса полимера

Mv - средневязкостная молекулярная масса полимера

Mw - средневесовая молекулярная масса полимера

Мп - среднечисловая молекулярная масса полимера

СА - степень ацетилирования

СДА - степень дезацетилирования

ХМК — хитин-меланиновый комплекс

ХзМК — хитозан меланиновый комплекс

БМК — белок-меланиновый комплекс

ВМХ - высокомолекулярный хитозан

НМХ — низкомолекулярный хитозан

ФСС — фермент-субстратное соотношение

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ДИСК - динитросалициловая кислота

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

КЧ - кислотное число

40 - число омыления

ПЧ - перекисное число

Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства

Хитин встречается,в наружном покрове членистоногих (ракообразные, насекомые), скелете морского зоопланктона, клеточной стенке грибов и дрожжей, трубках погонофор [1]. Хитин также присутствует в стенках цисты инфузории, клетках зеленых водорослей,, иглах диатомовых, стеблях золотистых и волокнах гаптофитовых водорослей [2]. Хитин отсутствует у прокариотных организмов и у растений, хотя в состав клеточной стенки бактерий входит муреин, содержащий К-ацетил-О-глюкозоамин. В живых организмах хитин образует микрофибриллярный порядок, что обеспечивает линейную конформацию молекул, закрепленную водородными связями. Эти фибриллы диаметром от 2,5 до 2,8 нм обычно входят в белковую матрицу [3].

Хитин присутствует в трех полиморфных модификациях с различной ориентацией хитиновых микрофибрилл: а, р, у. Наиболее распространена а-форма, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Она присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов. В /?-форме цепочки параллельны и обладают более высокой растворимостью и набуханием за счет более слабых межмолекулярных водородных связей [4]. Эта форма встречается у каракатицы, в гладиусе кальмара, внеклеточной сердцевине диатомей, трубках погонофор. у-Форма имеет смешанную систему параллельных и антипараллельных цепочек и присутствует в коконах насекомых [5]. /?- и у-Формы хитина переходят в а-форму под действием концентрированных кислот (муравьиной, азотной и соляной), которая является наиболее стабильной. Все три формы хитина могут встречаться и у одного организма, например, кальмара Loligo [6]. Это говорит о том, что различные формы хитина выполняют в организме разнообразные функции.

Хитин нерастворим в воде, разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и наиболее часто используемых органических растворителях, устойчив к действию многих химических реагентов. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солевых растворах при нагревании. В смеси диметилацетамида, №метил-2-пирролидона и хлористого лития, а также в гексафторпропаноле, гексафторацетоне вместе с водными растворами минеральных кислот хитин растворяется без разрушения полимерной структуры [3]. В растворах некоторых солей (например, тиоцианата лития) хитин переходит в коллоидный раствор. Он способен образовывать комплексы с органическими (холестерин, белки, пептиды) веществами, обладает высокой сорбционной способностью к тяжелым металлам, радионуклидам. Хитин не разлагается под действием ферментов млекопитающих, но разлагается некоторыми ферментами насекомых, грибов и бактерий, отвечающих за распад хитина в природе. В среднем молекулярный вес природного хитина составляет 106Да и более [7]. Среди разнообразных производных этого полимера наиболее доступным является хитозан, который получают в процессе деацетилирования хитина.

Важной характеристикой полимера является степень ацетилирования: отношение остатков N-ацетил-Д-глюкозоамина к общему количеству мономерных звеньев в полимере. Общепринято считать, что хитозан - это полимер со степенью ацетилирования ниже 50%. Степень ацетилирования влияет на свойства полимера и определяет растворимость в разбавленных растворах кислот (2 рН 6) [8]. Хитозан растворим в разбавленных неорганических кислотах (соляной, азотной) и органических (муравьиной, уксусной, янтарной, молочной, яблочной), нерастворим в лимонной и винной кислотах [9]:. Аминогруппы і молекулы хитозана имеют константу ионной диссоциации (рКа) 6,3-6,5 [10]. Ниже этого значения аминогруппы протонированы и хитозан представляет собой катионный; полиэлектролит, хорошо растворимый в воде. Выше - аминогруппы депротонированы и полимер не растворяется в водных растворах. Такая зависимость растворимости от рН позволяет получать хитозан в различных формах (капсулы, пленки, мембраны, гели, волокна и др.).

Растворимость хитозана в слабокислых водных растворах существенно повышается при понижении молекулярной массы и повышении степени деацетилирования. Высокомолекулярный хитозан со степенью деацетилирования 70-80% плохо растворяется, в водных растворах (рН 6,0-7,0), что существенно ограничивает возможности его практического применения. ,

Объекты исследований, исходные материалы и химические реагенты

В качестве сырья в работе использовали:

- весенний подмор пчел, предоставленный компанией ООО «Тенториум», г. Пермь. Подмор — это пчелы, погибшие, главным образом, в период зимовки и осыпавшиеся на дно улья. Объект исследования подмор пчел был получен из насекомых семейства медоносных пчел (Apis melliferd) среднерусской породы.

- крабовый высокомолекулярный (СДА 85%, ММ 790 кДа) и низкомолекулярный хитозаны (СДА 85%, ММ 28 кДа) предоставлены ЗАО «Биопрогресс», Московская область, Щелковский район.

Калий гидроокись (калий едкий) «ч.д.а.» ГОСТ 24363-80

Йодид калия (калий йодистый) «ч.д.а.» ГОСТ 4232-74

Перекись водорода технич. м. «А» (50,0%) ТУ 6-02-685-89

Глицерин «ч» ГОСТ 6259-75

Кислота уксусная ледяная «хч» (не менее 99,5%) ГОСТ 61-75

Натрий уксуснокислый 3-водный ГОСТ 199-78

Промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х на основе

штамма Trichoderma viride (Завод биологических препаратов г. Бердск,

Спирт этиловый ректификат (ТУ 19П-39-69)

Калий марганцовокислый (КМп04) (ГОСТ 20490-75)

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Железо (111) хлорид 6-ти водное, "Ч" ГОСТ 4147-74

3,5-Динитросалициловая кислота ("Sigma")

Водную экстракцию осуществляли следующим образом: подмор пчел, измельченный до размера частиц 1-3 мм в сухом измельчителе, помещали в колбу на 200 мл и добавляли дистиллированную воду для получения суспензии концентрацией 10%. Оптимизацию водной экстракции проводили в интервале температур 20-100С и продолжительности - 0,5-2 ч при постоянном перемешивании механической мешалкой. По окончании процесса смесь фильтровали через 6-слойный капроновый и стеклянный фильтры. Твердый остаток, представляющий собой обработанный подмор пчел, высушивали в сушильном шкафу при 30±5С в течение 24 ч, а фильтрат (суспензия меланина в воде) замораживали в жидком азоте и лиофильно высушивали. Определяли выход меланина и содержание остаточного белка по методу Брэдфорда.

Оптимизацию процесса обесцвечивания ХМК с концентрацией суспензии 30% проводили под действием 0,5-10%-ных растворов перекиси водорода в присутствии 0,1 н раствора NaOH, в интервале температур 20-80С и продолжительности процесса 0,5—4 ч. По окончании процесса твердый остаток обесцвеченного хитин-меланинового комплекса отделяли фильтрованием на капроновом фильтре, промывали до рН промывных вод 7,0 (по рН метру) и высушивали в сушильном шкафу при 30±5С.

Оптимизацию процесса деацетилирования обесцвеченного ХМК с концентрацией суспензии 15% осуществляли с использованием 35-55%-ных растворов NaOH в интервале температур 60-140G в течение 0,5 ч при постоянном перемешивании. По окончании процесса реакционную массу охлаждали до 40С и фильтровали на капроновом и стеклянном фильтрах. Полученный высокомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивали в сушильном шкафу при 30±5С.

Гидролиз 1%-ного раствора полимера в 0,2 М Na-ацетатном буфере проводили под действием трех ферментативных комплексов в оптимальных условиях для каждого:

Разработка технологии получения биологически активных веществ из подмора пчел

В состав кутикулы пчелы входят вещества различной природы: белки, полисахариды, пигменты, минеральные вещества. Для получения биологически активных веществ таких, как хитин, хитозан и меланин, представляющих несомненный интерес с точки зрения исследования их состава, структуры, физико-химических свойств, как индивидуальных полимеров, так и их комплексов друг с другом, необходимо разработать такую схему выделения, которая учитывала бы особенности исходного сырья. Характеристика подмора пчел приведена в таблице 9.

Как видно из таблицы 9, в подморе пчел содержится небольшое количество минеральных веществ (3-4%), что позволяет нам исключить стадию деминерализации из технологической схемы. Но присутствие большого количества пигмента меланина (до 40%), ковалентно связанного с белком склеротином в кутикуле, оказывает значительное влияние на свойства хитина и хитозана и обусловливает включение дополнительной стадии обесцвечивания.

При разработке универсальной технологической схемы получения биологически активных веществ из подмора пчел нами была проведена оптимизация каждой стадии обработки с целью подбора оптимальных параметров процесса.

Меланины всех таксономических групп нерастворимы в водных растворах и большинстве органических растворителях. Единственным почти универсальным растворителем для меланинов являются водные растворы щелочей NaOH и КОН. Однако в литературе были описаны факты получения водорастворимых фракций меланина, выделенные из микробного экзопигмента Psedomonas aeruginosa и мышиной меланомы [120], а также из трутового гриба чага Inonotus obliquus [130]. Было отмечено, что данные фракции пигмента представляли собой не чистый меланин, а комплексы, содержащие белковые и сахарные компоненты, и названные впоследствии меланопротеинами.

Как видно из таблицы 9, на долю меланиновых пигментов в кутикуле насекомого приходится от 20 до 40% химического состава. Для создания комплексной технологии переработки подмора пчел с получением веществ различной природы, нами предложено введение стадии водной экстракции, с целью выделения водорастворимой фракции меланина с сохранением нативной структуры полимера. Возможность выделения меланинов из кутикулы экстракцией в воду обусловлена тем, что они, в отличие от таких пигментов, как птерины и оммохромы, не образуют окрашенных гранул в цитоплазме, а пропитывают экзокутикулу, располагаясь между хитин-белковыми ламеллами и создавая равномерную окраску покрова [37]. В этой связи меланин насекомых можно отнести к экзопигментам.

Для улучшения процесса экстракции использовали измельченный подмор пчел, что позволило улучшить доступ реагента к сырью, а также увеличить выход продукта. Оптимизацию стадии водной экстракции проводили при температурах 20-100С и продолжительности процесса 0,5-2ч. Полученные экстракты после фильтрации высушивали лиофильно. Выход меланиновых пигментов и подмора пчел после водной экстракции приведен в таблице 10.

Читайте также: