Канцерогены, мутагены и проба Эймса на мутагенность
Обновлено: 25.04.2024
Многие опухоли у человека возникают в результате воздействия токсичных химических веществ. Поскольку эти химические канцерогены обычно мутагенны, можно думать, что повреждение ДНК лежит в основе и канцерогенеза, и мутагенеза. Эти соединения важно идентифицировать и оценить их потенциальную биологическую активность, чтобы свести к минимуму то воздействие, которое они оказывают на человека. Брюс Эймс (Bruce Ames) разработал простой и чувствительный тест для выявления химических мутагенов. На чашку Петри помещают тонкий слой агара, содержащий около клеток специально сконструированного тест-штамма Salmonella. Эти бактерии не способны расти в отсутствие гистидина, поскольку они несут мутацию в одном из генов биосинтеза этой аминокислоты. Добавление мутагена в центр чашки индуцирует появление множества новых
Рис. 26.14. Аналог тимина -бромурацил иногда спаривается с гуанином вместо аденина. Присутствие атома брома при увеличивает долю редкого таутомера, образующегося при сдвиге протона от к атому кислорода при
мутаций. Небольшая часть этих мутаций приводит к реверсии исходной мутации (возврат к дикому типу), так что клетки приобретают способность синтезировать гистидин. Эти ревертанты размножаются в отсутствие экзогенного гистидина и появляются в виде отдельных колоний на чашке после инкубации чашки в течение двух дней при 37°С (рис. 26.15). Например, -аминоан-трацена дают 11.000 колоний ревертантов по сравнению всего лишь с 30 спонтанными ревертантами в отсутствие этого мутагена. Можно легко поставить опыт с различными концентрациями исследуемого соединения, чтобы получить кривую доза-ответ. Обычно эта зависимость имеет линейный характер; отсюда следует, что пороговой концентрации в процессах мутагенеза нет.
Некоторые тест-линии чувствительны к заменам пар оснований, тогда как другие можно использовать для выявления делеций или вставок пар оснований (сдвигов рамки). Чувствительность этих штаммов, сконструированных специально для оценки мутагенов, увеличена генетически: они лишены системы эксцизионной репарации. Кроме того, у них нет липополисахаридной оболочки, которая обычно окружает клетки Salmonella. Отсутствие этого барьера облегчает проникновение в клетку потенциальных мутагенов. Еще одна важная особенность этой системы выявления мутагенов - добавление гомогената печени млекопитающих. Напомним, что некоторые потенциальные канцерогены превращаются в активную форму под действием ферментативных систем печени или других тканей млекопитающих (разд. 20.21). В бактериях эти ферменты отсутствуют, в связи с чем на чашку наносят несколько миллиграммов гомогената печени, чтобы активировать подобные мутагены. Например, соединение
Рис. 26.15. Тест на мутагены с использованием сальмонеллы. На чашку Петри посеяно примерно 109 бактерий, неспособных синтезировать гистидин. На чашку помещен кружок фильтровальной бумаги, пропитанный мутагеном. В результате возникает множество ревертантов, способных синтезировать гистидин. Эти ревертанты видны в виде ореола колоний вокруг белого кружочка. Небольшое число колоний на чашке спонтанные ревертанты. [Ames B.N., McCann J., Yamasaki E., Mutation Res., 31, 347 (1975).]
с реакционноспособной боковой цепью (дающее ему возможность образовать ковалентную связь с ДНК) и с ароматической группой (которое позволяет ему интеркалировать) обладает значительно большей мутагенностью, чем такое же соединение, состоящее из одной ароматической группы.
В настоящее время тест с использованием Salmonella широко используется для оценки опасности мутагенного и канцерогенного действия множества разнообразных химических соединений. Эта быстрая и недорогая бактериологическая проба на мутагенность дополняет эпидемиологические обследования и пробы на животных, которые всегда оказываются более трудоемкими, медленными и дорогими. Тест на мутагенность с использованием Salmonella - ответвление исследований взаимосвязи гена и белка у бактерий. Это - удивительный пример того, как фундаментальные исследования в области молекулярной биологии могут непосредственно внести важный вклад в здравоохранение.
Заключение
Последовательность оснований гена коллинеарна аминокислотной последовательности полипептидного продукта. Генетический код - это взаимосвязь между последовательностью оснований в ДНК (или соответствующего РНК-транскрипта) и последовательностью аминокислот в белках. Аминокислоты кодируются группами по три основания (они называются кодонами), начиная с фиксированной точки. 61 кодон из 64 кодирует определенную аминокислоту, а остальные три кодона и служат сигналами терминации. Таким образом, для большинства аминокислот имеется более одного кодового слова. Другими словами, код вырожден. Кодоны, определяющие одну и ту же аминокислоту, называются синонимами. В большинстве случаев синонимы различаются только последним основанием триплета. Некоторые последовательности вирусных ДНК кодируют более одного белка, так как их транскрипты транслируются в различных рамках считывания.
Генетический код един у всех живых организмов. Он был расшифрован в результате экспериментов трех типов. Во-первых, синтетические полирибонуклеотиды (полученные с помощью полинуклеотид-фосфорилазы) были использованы в качестве мРНК в бесклеточных системах синтеза белка, после того как было открыто, что кодирует фенилаланин. Во-вторых, тринуклеотид (подобный кодону в мРНК) специфически связывается с определенной тРНК, для которой он является кодовым словом. Были синтезированы все 64 трину-клеотида и проверена их способность стимулировать связывание определенных тРНК с рибосомами. В-третьих, в качестве мРНК были использованы синтетические полирибонуклеотиды с известной последовательностью. Например, на матрице синтезировался
Многие гены высших эукариот имеют «разорванное» строение. Кодирующие последовательности (экзоны) в таких генах разделены вставочными последовательностями (интронами), которые удаляются в ходе превращения первичного транскрипта в мРНК. Например, ген в-глобина млекопитающих содержит два интрона. Прерывистые гены, как и непрерывные гены, коллинеарны своим полипептидным продуктам.
Мутации обусловлены изменениями в последовательности оснований ДНК. Основные типы мутаций - замены, делеции и включения. Самый распространенный тип мутаций - замена одной пары оснований на другую. Замена одного пурина другим или одного пиримидина другим пиримидином называется транзицией. Трансверсия - замещение пурина пиримидином и наоборот. Мутации могут возникать вследствие спонтанной таутомеризации оснований или под действием аналогов оснований (например, -бромурацила) или других химических мутагенов (например, азотистой кислоты). Потенциальную канцерогенную активность многих веществ можно выявить по их мутагенному действию на бактерии.
Канцерогены и мутации - новые методы испытаний
Группы защиты животных настаивают на разработке новых методов испытания и на применении тестов, не требующих гибели или травмирования животных (особенно собак, кошек и обезьян) для проверки изучаемых веществ на безопасность для человека.
Сейчас разрабатывается ряд тестов, обеспечивающих более быструю и дешевую проверку на канцерогенность. В одной группе методов используются животные клетки, выращиваемые в культуре. Изменения в ДНК клеток, подвергающихся действию химикатов, могут быть связаны с развитием рака. Получены многообещающие результаты, но предстоит еще много работы над этой группой методов. В идеале используемые клетки должны были бы принадлежать человеку, но это пока невозможно.
Другой метод, названный пробой Эймса, уже применяется. Изучаемое вещество добавляют к культурам бактерий, а затем выясняют, не вызвало ли оно мутацию. В данном конкретном тесте исследователи выявляют обратные мутации, в результате которых мутантные бактерии, нуждающиеся для своего роста в гистидине, снова приобретают способность обходиться без него. Хотя в пробе Эймса выявляется мутагенность (способность вызывать мутации), а не канцерогенность, была обнаружена хорошая корреляция между этими двумя свойствами: 80% испытанных канцерогенов оказались также и мутагенами. Кроме того, большинство известных веществ, канцерогенных для человека, давало положительный результат и в пробах Эймса.
Из испытанных неканцерогенных веществ 87% дали в этих пробах отрицательный результат, и только 13%-ложный положительный результат. Эти цифры могут еще улучшиться по мере совершенствования метода. Было, например, показано, что некоторые вещества подвергаются в организме химическим изменениям и превращаются в канцерогены. Так, бензо(а)пирен становится канцерогеном после его преобразования в активную форму определенными компонентами клетки (микросомами). Если бензо(а)пирен испытать в пробе Эймса, он окажется немутагенным, но если в тест-систему добавить препарат микросомных ферментов печени, то будут возникать мутации.
Тест для выявления обратных мутаций, индуцированных мутагеном.
Каждая чашка Петри содержит в верхнем тонком слое краситель-тестер, а в чашках В и Г микросомную активирующую систему из печени. Для чашки Б эта система не требовалась. Мутагены наносили на кружочки фильтровальной бумаги диаметром 6 мм, которые помещали в центре каждой чашки. Индуцированные мутагеном обратные мутанты (ревертанты) появлялись в виде колоний вокруг каждого диска. А - контроль; Б - колонии ревертантов. индуцированных японской пищевой добавкой фурилфурамидом (1 мг); В-колонии ревертантов, образовавшиеся под действием плесневого канцерогена афлатоксина В2 (1 мг); Г -колонии, индуцированные 2-аминофлуореном (10 мг).
Несомненно, дальнейшие усовершенствования, подобные этому, увеличат точность проб Эймса и других «быстрых» методов, таких, как тесты с клеточными культурами. Проба Эймса - это быстрый метод (опыт проводится примерно за 3 дня), и он недорог (около 200-300 долларов на испытание одного вещества, тогда как обычный тест на крысах или мышах обходится в 100000 долларов). Однако этот метод не вполне надежен из-за возможности ложных отрицательных результатов: до 20% канцерогенных соединений могут не оказаться мутагенами. Таким образом, ни одно вещество не может быть сочтено безвредным на основании одной лишь пробы Эймса.
Наконец, еще в одной группе методов используется математическое моделирование на компьютерах; здесь по структуре данного вещества оценивают вероятность того, что оно окажется канцерогеном или, может быть, хорошим противоопухолевым препаратом.
Со временем должны быть разработаны какие-то сочетания методов, которые давали бы возможность выявлять все потенциальные канцерогены, прежде чем они смогут распространиться в окружающей среде.
Канцерогены, мутагены, тератогены: что значат эти слова?
Слово «канцероген» широко распространено и многие люди слышали его не раз. «Мутагены» и «тератогены» растиражированы меньше, но имеют не менее пугающее значение. «ЛИВЕНЬ. Living Asia» рассказывает, что вообще значат эти слова, какую опасность они несут, и как защитить себя от их воздействия.
КАНЦЕРОГЕНЫ
Это факторы окружающей среды, воздействие которых на организм человека или животного повышает вероятность возникновения злокачественных опухолей. Другими словами, факторы, которые способствуют появлению и развитию рака. Сегодня известно около 400 таких факторов химической, физической и биологической природы.
Как обезопасить себя от канцерогенов в овощах?
Нитраты – это химический канцероген, о котором многие так или иначе слышали. Основной источник их поступления в организм — овощи, которые выращивали с чрезмерным применением азотных удобрений.
Такие овощи можно определить:
- по внешнему виду: слишком ровные или крупные плоды, яркий цвет у зелени, белые прожилки внутри помидоров.
- и по вкусу: пресные дыни и арбузы, отсутствие сладости у персиков.
Минимизировать опасное воздействие нитратов можно с помощью очистки кожуры, вымачивания овощей в воде, их жарки, тушения и закваски.
Где еще могут встретиться канцерогены?
Некоторые пищевые добавки также могут быть химическими канцерогенами. Такие добавки запрещены законом во многих странах. Например, Е123-Амарант и Е121-Цитрусовый красный. Обращайте внимание на то, что написано на этикетках продуктов!
Другой химический канцероген – пероксид – вы рискуете получить при сильном нагревании растительного масла.
Большие дозы солнечных лучей, ионизирующее излучение, ожоги, травмы также могут привести к раку. Это физические канцерогены.
МУТАГЕНЫ
Это факторы, которые могут вызвать наследственные изменения — мутации.
Мутагены разделяют на физические, химические и биологические. Сейчас такие вещества обнаружены среди химических веществ, использующихся в промышленности и сельском хозяйстве, в косметике и лекарствах, в продуктах переработки нефти и органических растворителях.
Например
Мутагенность является побочным действием некоторых лекарственных средств – цитостатиков и антиметаболитов, используемых для лечения онкологических заболеваний и в качестве иммунодепрессантов.
Мутагенной активностью обладает также ряд противоопухолевых антибиотиков (актиномицин Д, адриамицин, блеомицин и другие).
Мутагенным воздействием обладает стирол, использующийся в производстве полиэфирных пластмасс, и хлорпрен, применяемый в производстве полихлорпреновых эластомеров.
ТЕРАТОГЕНЫ
Это химические, физические и биологические факторы, которые способствуют появлению аномалий и пороков развития эмбриона.
Какие они бывают и чем грозят?
- Алкоголь – задержка развития до и после рождения, задержка умственного развития, микроцефалия, недоразвитие лицевых структур с формированием характерного алкогольного лица, почечные и сердечные дефекты.
- Свинец – выкидыши и мертворождения.
- Витамин А и его производные (изотретиноин, этретинат, ретиноиды) – выкидыши, микрофтальмия, расщелина верхней губы и нёба, умственная отсталость.
- Радиация – микроцефалия, умственная отсталость.
Обратите внимание – большинство канцерогенных, мутагенных и тератогенных факторов имеют химическую природу.
Каждый год в мире синтезируется около 250 тысяч новых химических веществ, многие из которых (особенно при крупномасштабном производстве) попадают в окружающую среду. Немалое количество этих соединений оказывает негативное воздействие на здоровье человека.
Канцерогены, мутагены и проба Эймса на мутагенность
Кривошеева Л.В. 1 Хитрово И.А. 1 Оглоблина А.М. 1 Кирсанов К.И. 1 Лесовая Е.А. 1 Иванов А.А. 1 Белицкий Г.А. 1 Дмитриева О.В. 2 Якубовская М.Г. 1
В дымовых выбросах, отобранных при открытом сжигании пластмассовых и латексных отходов биомедицинских лабораторий, найдено высокое содержание канцерогенных и не канцерогенных полициклических ароматических углеводородов, их нитропроизводных и летучих N-нитрозаминов. Экстракты выбросов обладали выраженной мутагенной активностью в тесте Эймса, как с метаболической активацией, так и без нее, что свидетельствует о наличии в них проканцерогенных соединений и канцерогенов прямого действия. Кроме того экстракты обладали способностью разобщать клетки в монослое иммортализованных гепатоцитов крысы (один из эффектов промоции канцерогенеза) и индуцировать опухоли у личинок дрозофилы, гетерозиготных по гену супрессору опухолевого роста warts, гомологичного человеческому lats. Таким образом, открытое сжигание пластмассовых и латексных отходов биомедицинских учреждений представляет значительную мутагенную и канцерогенную опасность.
1 Кривошеева Л.В. Интегральная оценка мутагенного и канцерогенного потенциала дымовых выбросов при термическом уничтожении биомедицинских отходов / Кривошеева Л.В., Хитрово И.А., Иванов А.А., Белицкий Г.А. и др. // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10. – С. 1514–1523
2. Михасенок О.Я. Тенденции индустрии пластмасс // Журн. Полимерные материалы. Итоги и прогнозы. – 2003. – Вып.1. – С.6–9.
5. Жукова Г.Ф. Флуориметрический и хемилюминесцентный методы определения Nнитрозаминов / Жукова Г.Ф., Хесина А.Я., Кривошеева Л.В. и др. // Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. – М.: Брандес»-«Медицина» 1998. – С. 286–298.
6. Budunova I.V., Mittelman L.A., Belitsky G.A. The effect of complete carcinogens on intercellular transfer of lucifer yellow in fibroblast culture // Cell Biol Toxicol. – 1990. – № 6(1). – Р. 47–61.
8. International Standard ISO 10993-3:1992(E) Biological evaluation of medical devices. Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity. Method 471 Genetic toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay.
9. Naa M.R., Kooa S.K., Kim D.Y., Parkb S.D., Rhee S.K., Kanga K.W., Joe C. In vitro inhibition of gap junctional intercellular communication by chemical carcinogens // Toxicology. 1995. – № 98. – P. 199–206.
10. Scheepers P.T., Martens M.H., Velders D.D., Fijneman P., van Kerkhoven M., Noordhoek J., Bos R.P. 1-Nitropyrene as a marker for the mutagenicity of diesel exhaust-derived particulate matter in workplace atmospheres // Environ Mol Mutagen. – 1995. – № 25(2). – Р. 134–47.
11. Sidorov R.A.1, Ugnivenko E.G., Khovanova E.M., Belitsky G.A. // Mutat Res. – 2001. – № 15, 498 (1–2). – Р. 181–191.
12. Simoneit B.R., Medeiros P.M., Didyk B.M. Combustion products of plastics as indicator for refuse burning in the atmosphere // Environmental Science & Technology. – 10/2005. – № 39(18). – Р. 6961–6970.
13. Watanabe M., Noma Y. Influence of Combustion Temperature on Formation of Nitro-PAHs and Decomposition and Removal Behaviors in Pilot-Scale Waste Incinerator // Environ. Sci. Technol. – 2009. – № 43 (7). – P. 2512–2518.
Пластмассы являются универсальным полимерным материалом, производимым в массовом масштабе и используемым во всем мире. Их производство растет высокими темпами и еще в 2000 году достигло 150 млн тонн в год при ежегодном росте потребления около 7 % [2], увеличивая количество отходов в первую очередь за счет изделий одноразового использования. Для решения проблемы их утилизации и уничтожения создаются различные технологии переработки, однако значительная часть пластмасс попадает на свалки и подвергается случайному или преднамеренному сжиганию. Дым от открытого сжигания пластмассовых изделий содержит в корпускулярной фазе продукты деполимеризации пластика, летучие добавки и продукты их разложения [12]. Кроме того, как было ранее показано нами и другими авторами, в нем содержится множество токсичных соединений, в том числе обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и нитрозосоединения [1, 7]. В то же время мы не нашли работ, посвященных комплексному исследованию канцерогенной опасности выбросов, содержащих продукты прямого сжигания этих видов отходов. В предыдущем исследовании [1] нами была разработана система интегральной оценки канцерогенной опасности продуктов термической переработки твердых бытовых отходов, на основе которой мы предполагаем оценить канцерогенную опасность дымовых выбросов, образующихся при широко практикуемом открытом сжигании пластмассовых и латексных отходов.
Материалы и методы исследования
Работа включала физико-химические и биологические методы исследования. Объектом исследования служили дымовые выбросы при сжигании отходов изделий биомедицинского назначения (чашки Петри, пипетки и латексные перчатки).
Отсортированные изделия сжигали открытым способом. Отбор проб дымовых выбросов проводили с использованием автоматического пробоотборника «ОП-442ТЦ». Для определения ПАУ, нитро-ПАУ отбор проводили с объемной скоростью 5 л/мин на фильтры АФА-РМА-20; для определения летучих N-нитрозосоединений – с объемной скоростью 0,5 л/мин в жидкий поглотитель – 10 % раствор КОН.
Исследование канцерогенных составляющих в дымовых выбросах
Для определения состава и количества ПАУ и нитро-ПАУ фильтры трижды экстрагировали бензолом методом ультразвуковой экстракции (ультразвуковая установка Branson B-12, 50 Гц), экстракты анализируемой пробы объединяли и концентрировали до объема 10 мл. Часть экстракта отбирали для проведения биологических экспериментов. Выделение отдельных соединений проводили методом тонослойной хроматографии на окиси алюминия с использованием в качестве подвижной фазы смести бензол:гексан. Отобранные фракции экстрагировали бензолом; для проведения спектрального анализа в подготовленный к анализу экстракт добавляли н-октановый раствор соответствующего стандартного соединения. При проведении высокоэффективной жидкостной хроматографии экстракты переводили в ацетонитрил. Для биологических методов исследования, в частности, для проведения теста Эймса, первичную экстракцию проводили дихлорметаном.
Для качественного и количественного определения ПАУ и нитро-ПАУ был использован разработанный в нашей лаборатории высокочувствительный спектрально-люминесцентный метод, основанный на избирательном возбуждении спектров флуоресценции замороженных при 77°К поликристаллических н-октановых растворов (эффект Шпольского). Анализ исследуемых соединений осуществляли низкотемпературным спектрально–люминесцентным методом на спектрофлуориметре Hitachi M-850 (Япония) с двойным монохроматором на входе (возбуждение) и выходе (эмиссия люминесценции) и приставкой для низкотемпературной люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) с ксеноновым источником возбуждения [3, 4]
Определение N-нитрозаминов проводилось методом, основанным на извлечении исследуемых соединений водяным паром [5]. Из водного дистиллята экстракцию проводили хлористым метиленом. Экстракт высушивали Na2SO4 и концентрировали до необходимого объема. Анализ проводили методом газохроматографического разделения на хроматографе (газовый хроматограф) с термоэнергетическим детектором ТЕА 810 (Cambridge Scientific Instr.) и компьютерной системой регистрации и обработки данных.
Бактериальный тест на мутагенную активность (тест Эймса)
Изучение потенциальной мутагенной активности было проведено в соответствии с международным стандартом [8], заключающимся в регистрации способности испытуемого соединения (смеси соединений в экстракте) и/или его метаболитов индуцировать генные мутации типа сдвига считывания или замены пар оснований у индикаторных микроорганизмов (S. Typhymurium TA100 и TA98). Ввиду предполагаемого наличия в выбросах канцерогенов прямого и непрямого действия, была использована методика с активацией проканцерогенов микросомной фракцией клеток печени крысы и без активации. Мутагенный эффект экстрактов сравнивали с действием стандартных генотоксических канцерогенов. Результаты учитывали при наличии мутагенного эффекта во всех вариантах позитивного контроля и в нормальном фоновом варианте.
Тест на промотрную активность
Для изучения промоторной активности выбросов был адаптирован тест, регистрирующий нарушение межклеточных контактов в монослойной культуре клеток крысы [9]. Разобщая клетки, промоторы способствуют выживанию и пролиферации трансформированных злокачественных клеток. Показателем эффекта является ширина зоны распространения флуоресцирующего красителя по обе стороны от нанесенной на монослой царапины. Положительным контролем на разобщение является действие стандартного разобщителя – 12-О-тетродеканоил-форбол-ацетата (ТРА). В работе использовали линию иммортализованных клеток печени крысы IAR-2. Клетки рассевали на 6-луночные планшеты с покровными стеклами на дне. Через 24 часа после посева к клеткам добавляли экстракты в разведениях 1/100, 1/1000, и 1/10000 и инкубировали в течение 72 часов. Разобщение межклеточных контактов определяли после нанесения царапины как отношение среднего числа слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя для каждой концентрации исследуемого препарата к среднему числу слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя в контрольных образцах (клетки, обработанные растворителем). Количество слоев периферических от «раны» клеток подсчитывали на флуоресцентном микроскопе Zeiss с фотонасадкой (Axioplan 2 imaging), с использованием фильтра для FITC-флуоресценции и при 400-кратном увеличении. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для определения М ± m, где М – среднее значение, m – стандарная ошибка среднего, (стандартное отклонение/) с помощью пакета программ Microsoft Excel.
Индукция опухолей у дрозофилы (SMART-тест)
Для выявления бластомогенной активности исследуемых проб использовали оптимизированный протокол теста на соматический мутагенез и рекомбинацию на дрозофиле (SMART), разработанный в нашей лаборатории [11].
Тестирование проводили на личинках дрозофилы гетерозиготных по рецессивной мутации гена супрессора опухолевого роста warts (wts) гомолога человеческого lats. В гомозиготном состоянии этот мутантный ген вызывает опухоли из клеток имагинальных дисков, которые после вылета имаго можно обнаруживать и подсчитывать под бинокулярным микроскопом.
Скрещивание проводили, помещая по 10 самок и 5 самцов в пробирки со стандартной питательной средой на 36–40 ч. Личинок первого возраста F1 обрабатывали испытуемыми соединениями из расчёта 0,2 мл раствора тестируемого вещества на пробирку. В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду, поскольку ранее нами было показано, что нет различий в частоте появления клонов при обработке личинок дистиллированной водой, 10 % ДМСО, либо без обработки, в качестве положительного – 0,3 мМ водный раствор оксоплатина (Lachema, Чехия). В предварительных экспериментах по определению токсичности экстрактов дыма для дрозофилы было установлено, что минимальной нетоксической дозой является доза, соответствующая 0,05 л дымового выброса на пробирку. Взрослых самцов и самок из F1 просматривали под бинокулярной лупой на наличие опухолей. Подсчитывали количество просмотренных особей, количество опухолевых клонов и рассчитывали частоту опухолей на 100 особей.
Результаты исследования и их обсуждение
В первой стадии исследования в дымовых выбросах определяли содержание бенз(а)пирена, – индикаторного соединения, характеризующего наличие и состав основных приоритетных ПАУ.
Во всех образцах было отмечено высокое содержание БП, причем при сжигании латексных перчаток количество БП значительно превышало содержание этого соединения в дыме открытого сжигания несортированных бытовых отходов, как было показано нами в предыдущем исследовании (табл. 1).
В дымовых выбросах открытого сжигания образцов было определено количественное содержание ПАУ и ряда нитро-ПАУ, часть из которых обладает высокой канцерогенной и мутагенной активностью (табл. 2).
Канцерогены, мутагены и проба Эймса на мутагенность
Кривошеева Л.В. 1 Хитрово И.А. 1 Оглоблина А.М. 1 Кирсанов К.И. 1 Лесовая Е.А. 1 Иванов А.А. 1 Белицкий Г.А. 1 Якубовская М.Г. 1
В экстрактах дымовых выбросов от сжигания отходов определяли количественное содержание канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), мутагенность в тесте Эймса, способность разобщать контакты клеток млекопитающих и способность индуцировать опухоли у дрозофилы. Показано, что при неорганизованном сжигании твердых отходов в печи открытого типа с дымом выбрасывается большое количество канцерогенных ПАУ прямого и непрямого действия. Дымовой выброс специализированной установки ЭЧУТО 150-03 при сжигании пластмассовых отходов биомедицинского назначения в беспиролизном режиме содержит в несколько раз меньше этих соединений, причем только проканцерогенов, активируемых системой цитохрома Р450. Экстракты этого дыма содержат соединения, разобщающие клеточные контакты, то есть промоторы канцерогенеза. В то же время в них не содержится достаточного количества генотоксических канцерогенов, способных вызывать опухоли у дрозофилы. Низкое содержание в выбросе отдельных сильных канцерогенов не может служить показателем его мутагенной и канцерогенной безопасности, поскольку экстракты дыма от беспиролизного сжигания пластмасс, содержавшие бенз(а)пирен и бензфлуорантен в количестве на порядок ниже минимально мутагенного, вызывали значительное количество реверсий штаммов сальмонеллы в тесте Эймса. Включение пиролиза в цикл работы установки ЭЧУТО 150-03 уменьшает содержание канцерогенов в дыме на один-два порядка по сравнению с беспиролизным режимом и приближает его к ПДК в воздухе рабочей зоны. Экстракты этого дыма не обладают мутагенной активностью, но сохраняют способность разобщать клетки. Таким образом, реальная оценка генотоксической опасности продуктов термической переработки отходов возможна только при сочетании физико-химических и биологических методов.
1. Аветов Г.А., Аствацатуров, Двоскин Г.И. Процесс пиролиза как основа технологии экологически чистого уничтожения твердых органоспецифических отходов строительного производства // Научно-технический и производственный журнал нефтегазового строительства. – 2013. – № 2. – C. 47–49
2. Белицкий Г.А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. Совол как индуктор микросомальных ферментов, активирующих проканцерогены // Экспериментальная онкология. – 1987. – Т.9, № 3. – С. 20–23.
3. Молчанова И.В., Константинова Т.М., Двоскин Г.И. Применение установок «ЭЧУТО-150» для решения задач по обезвреживанию, обеззараживанию, переработке и утилизации медицинских отходов // Медицинские отходы: проблемы и пути решения: Сб. матер. III Всероссийской научной конф. с международным участием. (Москва, 26–30 мая 2014 г.). – М., 2005. – С. 46–48.
4. Ровинский Ф.Я. Теплицкая Т.А,. Алексеева Т.А. Фоновый мониторинг полициклических ароматических углеводородов. – Л.: Гидрометеоиздат, 1988. – 224 с.
7. Шафран Л.М, Басалаева Л.В., Копа М.Р. Сравнительные санитарно-гигиенические исследования газообразных продуктов термоокислительной деструкции и пиролиза полимерных материалов // Актуальные проблемы транспортной медицины. – 2009. – № 4(18). – С. 124–131
8. Ayollo DV, Zhitnyak IY, Vasiliev JM, Gloushankova NA. Rearrangements of the actin cytoskeleton and E-cadherin-based adherens junctions caused by neoplasic transformation change cell-cell interactions // PLoS One. – 2009. – № 4(11). – 8027 р.
9. Budunova IV, Mittelman LA, Belitsky GA. The effect of complete carcinogens on intercellular transfer of lucifer yellow in fibroblast culture // Cell Biol Toxicol. – 1990. – № 6(1). – Р. 47–61.
11. International Standard ISO 10993-3:1992(E) Biological evaluation of medical devices. Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity. Method 471 Genetic toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay.
12. Kiran Ciliz N1, Ekinci E, Snape CE. Pyrolysis of virgin and waste polypropylene and its mixtures with waste polyethylene and polystyrene // Waste Manag. – 2004. – № 24(2). – Р. 173–181
13. Maron D.M., Ames B.N. Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test // Mutat Res. – 1983. – № 113(3–4). – Р. 173–215.
14. Sidorov RA1, Ugnivenko EG, Khovanova EM, Belitsky GA. Mutat Res. – 2001. – № 15, 498 (1–2). – Р. 181–91.
15. Yamasaki H, Naus CC. Role of connexin genes in growth control // Carcinogenesis. – 1996. – № 17(6). – Р. 1199–1213.
При термической переработке отходов образуются сложные продукты, которые в различных сочетаниях попадают в окружающую среду. Часть из них представляет реальную канцерогенную и генетическую опасность, масштабы которой постоянно возрастают. Общепринятых критериев реальной оценки этой опасности не существует, поскольку она складывается не из суммы количественного содержания отдельных канцерогенов в выбросах, а формируется при участии модифицирующего действия многих других содержащихся в них соединений. В связи с этим эффективным способом экспрессной оценки потенциального онкологического риска сложных смесей может быть только сочетание данных физико-химического анализа с результатами оценки суммарной мутагенной и канцерогенной активности в биологических тестах.
Методологическим подходом исследования послужила двухстадийная теория химического канцерогенеза, в соответствии с которой опухоль возникает в результате сочетанного действия инициирующих факторов, вызывающих злокачественную трансформацию клетки и промоторов, способствующих реализации ее потенциала. В связи с этим помимо определения количественного состава канцерогенных соединений в выбросах исследовали их мутагенную и промоторную активность. Кроме того, индуцировали опухоли у гетерозиготных личинок дрозофилы.
Цель работы – разработка системы оценки канцерогенной опасности выбросов, образующихся при разной технологии термического разложения биомедицинских отходов.
Материалы и методы исследования
Исследованию подвергалась корпускулярная фаза воздушного выброса, образующегося при термическом разложении пластмассовых изделий биомедицинского назначения, отсортированных по виду изделий и типу пластмассы. Данный объект был избран потому, что относительно низкая стоимость пластмасс и простота их обработки создали возможность массового производства изделий, широко применяемых в клинике и научных учреждениях медицинского профиля.
Отходы перерабатывали на новой, ранее не эксплуатировавшейся установке «ЭЧУТО-150.03» («Экологически чистая утилизация твердых отходов» (рисунок)), основным технологическим принципом работы которой является непрямое двухступенчатое сжигание, включающее предварительное термическое разложение (пиролиз) органической части исходного сырья, сжигание газообразных продуктов и дожиг коксового остатка [2, 7].
Для исследования влияния пиролиза на состав и количество канцерогенных соединений в выбросах термическую переработку проводили по двум схемам – с использованием процесса пиролиза и без пиролиза. Для сравнения часть несортированных отходов сжигали в печи открытого типа. Отбор корпускулярной фазы воздушного выброса проводили автоматическим пробоотборником «ОП-442ТЦ» с объемной скоростью 10 л/мин на фильтры АФА-РМА-20.
Установка «ЭЧУТО 150-03»
Исследование полициклических ароматических углеводородов в выбросах при термическом разложении отходов
Для определения состава и количества канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) фильтры экстрагировали бензолом три раза по 50 мл на ультразвуковой бане (Branson B-12, 50 Гц) по пятнадцать минут; все экстракты анализируемой пробы объединяли и концентрировали до объема 10 мл. Часть экстракта отбирали для проведения биологических экспериментов. Для качественного и количественного определения ПАУ был использован разработанный в нашей лаборатории высокочувствительный спектрально-флуориметрический метод, основанный на избирательном возбуждении спектров флуоресценции замороженных при 77 °К поликристаллических н-октановых растворов (эффект Шпольского). Анализ исследуемых соединений осуществляли низкотемпературным спектрально–люминесцентным методом на спектрофлуориметре Hitachi M-850 (Япония) с двойным монохроматором на входе (возбуждение) и выходе (эмиссия люминесценции) и приставкой для низкотемпературной люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) с ксеноновым источником возбуждения [1, 12]
Тест Эймса. Индукция генных мутаций в системе сальмонелла/микросомы [13] проводилась в соответствии с международным стандартом [11]на индикаторных штаммах Salmonella typhimurium ТА100, дающих обратные мутации по механизму замены пар оснований и ТА98, мутирующей в результате сдвига рамки считывания. Метаболическую активацию промутагенных соединений осуществляли микросомной фракцией гомогената печени крыс линии «Вистар» с предварительной индукцией ферментов системы цитохрома P450 смесью полихлорированных бифенилов «Совол» [2]
Бензольные экстракты дымовых выбросов упаривали досуха, остаток растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), инкубировали в пробирках с 0,6 % селективным полуобогащенным агаром, суспензией бактерий и микросомальной активирующей смесью S9, либо растворителем. Далее содержимое пробирок наносили на слой минимального агара без гистидина в чашках Петри. Позитивным контролем служили стандартные мутагены. В качестве прямого мутагена для штамма ТА100 использовали азид натрия или нитрозогуанидин, для штамма ТА98 2,7-диамино-4,9диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен (ДДДТДП). Способность фракции S9 активировать промутагены контролировали бенз/a/пиреном (БП) и 2-ацетиламинофлуореном (ААФ) для обоих штаммов. Учет результатов проводили через 48–72 часа инкубации при 37 °С. Наличие и величину мутагенного эффекта определяли по количеству колоний обратных ревертантов. В каждом варианте использовали по 3 чашки Петри на дозу.
Тест на нарушение метаболической кооперации клеток
В работе использовали линию иммортализованных клеток печени крысы IAR-2 [8]. Клетки рассевали на 6-луночные планшеты с покровными стеклами на дне. Через 24 часа после посева к клеткам добавляли экстракты в разведениях 1/100, 1/1000, 1/10000 и 1/100000 и инкубировали в течение 72 часов. За 2 часа до проведения эксперимента клетки, служащие положительным контролем, обрабатывали TPA (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат) (Cell Signaling Technology) в концентрации 5 нг/мл. После окончания инкубации клетки дважды промывали PBS, покрывали раствором люминесцентного индикатора (люцифер желтый) и наносили на монослой клеток царапины хирургическим скальпелем. Затем клетки инкубировали 2 минуты при 37 °С, во влажной атмосфере без доступа света, трижды промывали PBS в течение 1 мин при комнатной температуре. После промывки клетки покрывали фиксирующим раствором и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Стекла с клеточным монослоем исследовали на флуоресцентном микроскопе Zeiss с фотонасадкой (Axioplan 2 imaging), с использованием фильтра для FITC-флуоресценции и при 400-кратном увеличении.
Для каждой исследуемой дозы экстракта делали 10 независимых снимков области монослоя клеток, прилегающих к линии царапины. Разобщение межклеточных контактов определяли как отношение среднего числа слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя для каждой концентрации исследуемого препарата к среднему числу слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя в контрольных образцах (клетки, обработанные растворителем).
Индукция опухолей у дрозофилы
Тестирование проводили на гетерозиготах wtsP4/ + , полученных путем скрещивания: ♀ w; wtsP4/TM3 х ♂ D-32 по методике, описанной нами ранее [14]
Родителей скрещивали массово, помещая по 10 самок и 5 самцов в пробирки со стандартной питательной средой на 36–40 часов. Личинок первого возраста F1 обрабатывали испытуемыми соединениями из расчёта 0,2 мл раствора тестируемого вещества на пробирку (10 % экстракта корпускулярной фазы выброса в диметилсульфоксиде + 90 % дистиллированной воды). В качестве отрицательного контроля использовали 10 % ДМСО в дистиллированной воде, в качестве положительного – 3 мМ водный раствор оксоплатина (Lachema, Чехия).
Взрослых самцов и самок из F1 просматривали под бинокулярной лупой на наличие опухолей. Подсчитывали количество просмотренных особей (N), количество опухолевых клонов (ОК), рассчитывали частоту опухолей на 100 особей p = (ОК/N)∙100 %.
Во всех экспериментах статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для определения М ± m, где М – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего, (стандартное отклонениеРезультаты исследования и их обсуждение
В дыме печи открытого типа и установки ЭЧУТО было измерено содержание 6 ПАУ, из которых БП и БФЛ обладают высокой канцерогенной и мутагенной активностью. Количество всех ПАУ в дыме печи неорганизованного сжигания было на порядки выше, чем в выбросах установки ЭЧУТО, работавшей для сравнимости результатов по технологической схеме, не включающей процесс пиролиза (табл. 1).
Максимальное содержание БП в выбросах этой установки при сжигании пластмасс без пиролиза составило 65,85 мкг/мз, т.е. было в 33 раза меньше, чем в дымовом выбросе печи открытого типа, а БФЛ в 170 раз (табл. 1). В случае сжигания с пиролизом количество ПАУ в выбросе ЭЧУТО снизилось еще на 1–2 порядка и приблизилось по содержанию БП к ПДК в воздухе рабочей зоны, которая составляет 0,15 мкг/м3 (табл. 2).
Это связано с тем, что при пиролизе пластмассы разлагаются на простые олефины, которые сгорают при высокой температуре практически полностью [12, 7].
Выяснилось, что дымовые выбросы от сгорания различных изделий из одного и того же вида пластмасс образуют разное количество БП (табл. 2). В частности, сжигание без пиролиза полистироловых флаконов для культивирования клеток давало в несколько раз больше БП, чем сжигание других изделий из полистирола. Это связано с тем, что название «полистирол» объединяет ряд вариантов с различным строением молекулы. В исходном виде полистирол гидрофобен и не пригоден для изготовления флаконов, в которых культивируются клетки, поскольку они не могут прикрепляться к их поверхности. Для повышения гидрофильности и улучшения условий адгезии клеток в его состав вводят дополнительные NH2 группы.
Содержание ПАУ в дымовых выбросах при сжигании отходов в печи открытого типа и в установке ЭЧУТО без пиролиза
Читайте также: